﻿releasing murine neural stem cells by stereotaxic intracerebroventricular injection of release cocktail

الفئران "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن

Tissue-specific stem cells are partially committed cells that can give rise to all cell populations that constitute the respective tissues. Apart from being multipotent, they are self-renewing cells and crucial for maintaining the homeostasis and the regenerative capacity of tissues1. Some tissue-specific stem cells remain in an active, strongly proliferative state, such as intestinal or hematopoietic stem cells. Others, such as brain stem cells, remain largely quiescent or dormant2. In the adult brain, neural stem cells (NSCs) can be found in specialized areas, often called niches. Two such well described areas exist in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles and in the dentate gyrus of the hippocampus. The SEZ niche generates the highest numbers of cells, primarily neuroblasts that migrate toward the olfactory bulbs and contribute to the local interneuron population; in contrast, generated oligodendroblasts migrate to the adjacent corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are mitotically active cells, widely distributed throughout the central nervous system, that: i) are committed to the oligodendroglial lineage, ii) can migrate to sites of demyelination, and iii) can differentiate into myelinating oligodendrocytes. OPCs also exhibit self-renewal potential and quiescence4.
Until now, the isolation and study of NSCs and OPCs required postmortem dissociation of the dissected brain and spinal cord tissue. To circumvent this experimental limitation, we established a method that allows, for the first time, the isolation of brain NSCs and OPCs from live animals. We call this method &#34;milking&#34;, because it enables multiple collections of cells as their pools are not depleted. The protocol was developed in rats, due to their large brain size, targeting mainly the SEZ, or the CC, and includes two major steps. First, NSCs or OPCs are &#34;removed&#34; from the tissue via i.c.v. injection of a &#34;release cocktail&#34; containing neuraminidase, a toxin that induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor 2 (FGF2). The cocktail is stereotaxically injected bilaterally within the lateral ventricles. If the intended use is the isolation of NSCs, rostral areas of the lateral ventricles are targeted. If the aim is to isolate OPCs more purely, the cocktail is injected caudally in the area of the hippocampal fimbria. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid (CSF) are performed from the cisterna magna of anesthetized rats, without the need of an incision. The liquid biopsy is mixed with NSC culture medium and can be kept at 4 &#176;C until plating.

تسليط الضوء على المؤلف: جمع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية من الحية باستخدام بروتوكول حلب الدماغ الجديد 

طريقة "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن من الفئران الحية

We are working with brain neural stem cells, very sparse cells that cluster within specialized microenvironments called niches. Although they contribute to olfaction, memory, and learning, they are extremely inefficient in driving regeneration. Thus, we investigate their properties and ways to manipulate them to increase the healing of the nervous tissue.We have shown that the contribution of brain neural stem cells to regeneration is limited by endogenous and endogenous factors, such as their restricted differentiation potential, and their dependence on microenvironment factors. Equally, we have identified key properties that can be used to devise strategies to modulate their capacity. The milking protocol allows the collection of brain neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from live experimental animals.Thus, it allows a more uninterrupted analysis of their properties and the performance of longitudinal studies. Currently, there are no alternative techniques for the isolation of brain murine stem and progenitor cells from live experimental animals. The present standard of comparison is the postmortem isolation of such cells, which introduces various experimental uncertainties and biological bias.We are now investigating how brain neural stem cells become activated by existing quiescence. We are also comparing the properties of different progenitor populations of the brain. For example, neurogenic versus oligodendrogenic, in order to define their differential properties and their adaptations to varied microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about ﻿Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail at JoVE.com

Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail   

إطلاق الخلايا الجذعية العصبية للفأر عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي لكوكتيل الإطلاق 

ابدأ بإعطاء 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد للفأر المخدر. جبل الفئران على الإطار المجسم. بعد ذلك ، استخدم ماكينة حلاقة لحلق الفراء من الرأس.تطهير الجلد مع ثلاث جولات بالتناوب من 10 ٪ من اليود البوفيدون والكحول ، وذلك باستخدام مسحات القطن معقمة ، وفرك في اتجاهات مختلفة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان في كل مرة. ضع مرهم العين لمنع الجفاف. الآن ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين على طول خط الوسط للرأس باستخدام مشرط معقم ، ثم نظف الجمجمة بدقة باستخدام مسحات معقمة ومحلول ملحي.حدد البريجما باستخدام إبرة حقنة هاملتون سعة 10 ميكرولتر مثبتة على جهاز التجسيم واضبطها على 00. حرك إحداثيات الجهاز الأمامية الخلفية والجانبية. قم بإنشاء ثقب لدغ ملليمتر واحد باستخدام مثقاب الأسنان.قم بتحميل أربعة ميكرولترات من كوكتيل الإطلاق في حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر ، ثم اخفض الإبرة بعناية بحافة حادة أو مخروطية للاتصال بالجافية. أدخل الإبرة إلى العمق المطلوب البالغ 3.5 ملم. لبث اثنين ميكرولتر من كوكتيل الإفراج بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة.اترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقتين إضافيتين ، ثم استركبها ببطء لمنع ظهور كوكتيل الإطلاق. خياطة شق باستخدام 5/0 النايلون وتنظيف المنطقة خياطة مع مطهر. ثم نقل إلى منطقة مراقبة ما بعد العملية.أدى حقن أكثر من ثلاثة ميكرولتر من كوكتيل الإطلاق إلى إصابات ميكانيكية غير محددة. أدى حقن اثنين من ميكرولتر من الكوكتيل إلى ظهور مجموعات إيجابية مناعية مزدوجة الكورتين كانت مرئية حتى بعد ثمانية أشهر. كشف تلطيخ الدماغ المناعي عن مواقع التعرية على طبقة البطانة العصبية ، بالقرب من مستوى الحقن فقط.لوحظ انخفاض تدريجي في اضطرابات طبقة البطانة العصبية في المناطق الخلفية والأمامية من المنطقة تحت البطانة العصبية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

﻿Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...