﻿releasing murine neural stem cells by stereotaxic intracerebroventricular injection of release cocktail

Rat "Brain Milking" voor isolatie van neurale stam- en oligodendrocytvoorlopercellen

Tissue-specific stem cells are partially committed cells that can give rise to all cell populations that constitute the respective tissues. Apart from being multipotent, they are self-renewing cells and crucial for maintaining the homeostasis and the regenerative capacity of tissues1. Some tissue-specific stem cells remain in an active, strongly proliferative state, such as intestinal or hematopoietic stem cells. Others, such as brain stem cells, remain largely quiescent or dormant2. In the adult brain, neural stem cells (NSCs) can be found in specialized areas, often called niches. Two such well described areas exist in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles and in the dentate gyrus of the hippocampus. The SEZ niche generates the highest numbers of cells, primarily neuroblasts that migrate toward the olfactory bulbs and contribute to the local interneuron population; in contrast, generated oligodendroblasts migrate to the adjacent corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are mitotically active cells, widely distributed throughout the central nervous system, that: i) are committed to the oligodendroglial lineage, ii) can migrate to sites of demyelination, and iii) can differentiate into myelinating oligodendrocytes. OPCs also exhibit self-renewal potential and quiescence4.
Until now, the isolation and study of NSCs and OPCs required postmortem dissociation of the dissected brain and spinal cord tissue. To circumvent this experimental limitation, we established a method that allows, for the first time, the isolation of brain NSCs and OPCs from live animals. We call this method &#34;milking&#34;, because it enables multiple collections of cells as their pools are not depleted. The protocol was developed in rats, due to their large brain size, targeting mainly the SEZ, or the CC, and includes two major steps. First, NSCs or OPCs are &#34;removed&#34; from the tissue via i.c.v. injection of a &#34;release cocktail&#34; containing neuraminidase, a toxin that induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor 2 (FGF2). The cocktail is stereotaxically injected bilaterally within the lateral ventricles. If the intended use is the isolation of NSCs, rostral areas of the lateral ventricles are targeted. If the aim is to isolate OPCs more purely, the cocktail is injected caudally in the area of the hippocampal fimbria. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid (CSF) are performed from the cisterna magna of anesthetized rats, without the need of an incision. The liquid biopsy is mixed with NSC culture medium and can be kept at 4 &#176;C until plating.

Auteur in de schijnwerpers: neurale stam- en voorlopercellen verzamelen van levende dieren met behulp van een nieuw hersenmelkprotocol 

De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

We are working with brain neural stem cells, very sparse cells that cluster within specialized microenvironments called niches. Although they contribute to olfaction, memory, and learning, they are extremely inefficient in driving regeneration. Thus, we investigate their properties and ways to manipulate them to increase the healing of the nervous tissue.We have shown that the contribution of brain neural stem cells to regeneration is limited by endogenous and endogenous factors, such as their restricted differentiation potential, and their dependence on microenvironment factors. Equally, we have identified key properties that can be used to devise strategies to modulate their capacity. The milking protocol allows the collection of brain neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from live experimental animals.Thus, it allows a more uninterrupted analysis of their properties and the performance of longitudinal studies. Currently, there are no alternative techniques for the isolation of brain murine stem and progenitor cells from live experimental animals. The present standard of comparison is the postmortem isolation of such cells, which introduces various experimental uncertainties and biological bias.We are now investigating how brain neural stem cells become activated by existing quiescence. We are also comparing the properties of different progenitor populations of the brain. For example, neurogenic versus oligodendrogenic, in order to define their differential properties and their adaptations to varied microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about ﻿Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail at JoVE.com

Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail   

Neurale stamcellen van muizen vrijgeven door stereotactische intracerebroventriculaire injectie van afgiftecocktail 

Begin met het subcutaan toedienen van 0,3 milligram per milliliter buprenorfine aan de verdoofde rat. Monteer de rat op het stereotaxische frame. Gebruik vervolgens een scheermes om de vacht van het hoofd te scheren.Desinfecteer de huid met drie afwisselende rondes van 10% povidonjodium en alcohol, met behulp van steriele wattenstaafjes, waarbij u elke keer drie tot vijf seconden in verschillende richtingen wrijft. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen. Maak nu een incisie van twee centimeter langs de middellijn van het hoofd met een steriel scalpel en reinig vervolgens de schedel zorgvuldig met steriele wattenstaafjes en zoutoplossing.Identificeer het bregma met behulp van een Hamilton-spuitnaald van 10 microliter die op het stereotaxische apparaat is gemonteerd en stel deze in op 00. Verplaats het apparaat naar de voorste, posterieure en laterale coördinaten. Maak een braamgat van een millimeter met behulp van een tandartsboor.Laad vier microliter van de afgiftecocktail in de Hamilton-spuit van 10 microliter en laat de naald vervolgens voorzichtig zakken met een stompe of conische rand om contact te maken met de dura. Steek de naald in tot de gewenste diepte van 3,5 millimeter. Laat twee microliter van de vrijkomende cocktail trekken met een snelheid van één microliter per minuut.Laat de naald nog twee minuten op zijn plaats zitten en haal hem dan langzaam terug om te voorkomen dat de vrijgavecocktail aan de oppervlakte komt. Hecht de incisie met 5/0 nylon en reinig het gehechte gebied met een antisepticum. Breng het dier vervolgens over naar het bewakingsgebied na de operatie.Injectie van meer dan drie microliter van de afgiftecocktail leidde tot niet-specifieke mechanische verwondingen. Injectie van twee microliter van de cocktail leidde tot het ontstaan van immunopositieve clusters met dubbele cortine die zelfs na acht maanden zichtbaar waren. Immunokleuring van de hersenen onthulde denudatieplaatsen op de ependymale laag, dicht bij alleen het niveau van injecties.Een geleidelijke afname van de verstoringen van de ependymale laag werd waargenomen op meer posterieure en meer anterieure gebieden van de subependymale zone.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

﻿Releasing Murine Neural Stem Cells by Stereotaxic Intracerebroventricular Injection of Release Cocktail

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...