Name: Beyin Omurilik Sıvısı Sıvı Biyopsisi ile Murin Nöral Kök ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin Toplanması
Uploaded: 2024-02-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collecting Murine Neural Stem and Oligodendrocyte Progenitor Cells by Cerebrospinal Fluid Liquid Biopsy at JoVE.com

collecting murine neural stem and oligodendrocyte progenitor cells by cerebrospinal fluid liquid biopsy

Nöral Kök ve Oligodendrosit Progenitör Hücre İzolasyonu için Sıçan "Beyin Sağım"

Tissue-specific stem cells are partially committed cells that can give rise to all cell populations that constitute the respective tissues. Apart from being multipotent, they are self-renewing cells and crucial for maintaining the homeostasis and the regenerative capacity of tissues1. Some tissue-specific stem cells remain in an active, strongly proliferative state, such as intestinal or hematopoietic stem cells. Others, such as brain stem cells, remain largely quiescent or dormant2. In the adult brain, neural stem cells (NSCs) can be found in specialized areas, often called niches. Two such well described areas exist in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles and in the dentate gyrus of the hippocampus. The SEZ niche generates the highest numbers of cells, primarily neuroblasts that migrate toward the olfactory bulbs and contribute to the local interneuron population; in contrast, generated oligodendroblasts migrate to the adjacent corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are mitotically active cells, widely distributed throughout the central nervous system, that: i) are committed to the oligodendroglial lineage, ii) can migrate to sites of demyelination, and iii) can differentiate into myelinating oligodendrocytes. OPCs also exhibit self-renewal potential and quiescence4.
Until now, the isolation and study of NSCs and OPCs required postmortem dissociation of the dissected brain and spinal cord tissue. To circumvent this experimental limitation, we established a method that allows, for the first time, the isolation of brain NSCs and OPCs from live animals. We call this method &#34;milking&#34;, because it enables multiple collections of cells as their pools are not depleted. The protocol was developed in rats, due to their large brain size, targeting mainly the SEZ, or the CC, and includes two major steps. First, NSCs or OPCs are &#34;removed&#34; from the tissue via i.c.v. injection of a &#34;release cocktail&#34; containing neuraminidase, a toxin that induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor 2 (FGF2). The cocktail is stereotaxically injected bilaterally within the lateral ventricles. If the intended use is the isolation of NSCs, rostral areas of the lateral ventricles are targeted. If the aim is to isolate OPCs more purely, the cocktail is injected caudally in the area of the hippocampal fimbria. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid (CSF) are performed from the cisterna magna of anesthetized rats, without the need of an incision. The liquid biopsy is mixed with NSC culture medium and can be kept at 4 &#176;C until plating.

Yazar Spotlight: Yeni Bir Beyin Sağım Protokolü Kullanarak Canlı Hayvanlardan Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Toplanması 

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

We are working with brain neural stem cells, very sparse cells that cluster within specialized microenvironments called niches. Although they contribute to olfaction, memory, and learning, they are extremely inefficient in driving regeneration. Thus, we investigate their properties and ways to manipulate them to increase the healing of the nervous tissue.We have shown that the contribution of brain neural stem cells to regeneration is limited by endogenous and endogenous factors, such as their restricted differentiation potential, and their dependence on microenvironment factors. Equally, we have identified key properties that can be used to devise strategies to modulate their capacity. The milking protocol allows the collection of brain neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from live experimental animals.Thus, it allows a more uninterrupted analysis of their properties and the performance of longitudinal studies. Currently, there are no alternative techniques for the isolation of brain murine stem and progenitor cells from live experimental animals. The present standard of comparison is the postmortem isolation of such cells, which introduces various experimental uncertainties and biological bias.We are now investigating how brain neural stem cells become activated by existing quiescence. We are also comparing the properties of different progenitor populations of the brain. For example, neurogenic versus oligodendrogenic, in order to define their differential properties and their adaptations to varied microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about Collecting Murine Neural Stem and Oligodendrocyte Progenitor Cells by Cerebrospinal Fluid Liquid Biopsy at JoVE.com

Beyin Omurilik Sıvısı Sıvı Biyopsisi ile Murin Nöral Kök ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin Toplanması

Başlamak için, daha önce serbest bırakma kokteyli ile intraserebroventriküler olarak enjekte edilen anestezi uygulanmış sıçana subkutan analjezi uygulayın. Fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin. Kulak çubuklarını kullanarak başı sabitleyin, öne ve arkaya doğru dönme hareketinin engellenmemesini sağlayın.Boynun arkasını düzgün bir şekilde uzatmak için başınızı 40 derecelik bir açıyla aşağı doğru sabitleyin. Boyun kürkünü bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin ve steril pamuklu çubuklar kullanarak cildi üç alternatif %10 povidon iyot ve alkol ile dezenfekte edin, her seferinde üç ila beş saniye boyunca farklı yönlere sürün. Parmak ucuyla, oksipital çıkıntı ile atlasın omurgası arasındaki yuvarlak şekilli bastırılabilir alanı tanımlayın.Bu noktayı bir işaretleyici kullanarak işaretleyin. Bir mililitrelik bir şırıngayı stereotaksik çerçeveye sabitleyin. İğneyi işaretteki cilde temas edecek şekilde konumlandırın.Forseps kullanarak, şırıngayı cilt katmanlarından geçirirken cildi kaldırın. Şırınganın içinde negatif basınç oluşturmak için pistonu yavaşça geri çekin. Şırıngada beyin omurilik sıvısı görünene kadar iğneyi yavaş yavaş sokun.İğneyi bu pozisyonda sabit tutun ve beyin omurilik sıvısının yavaş akışına izin verin. Beyin omurilik sıvısını 120 mikrolitreye kadar yavaşça çıkarın. Şırıngayı dikkatlice alın.Deney hayvanının sıvı ikmalini desteklemek için intraperitoneal olarak bir mililitre normal serum uygulayın. Sıvı biyopsiyi 400 mikrolitre nöral kök hücre ortamı ile birleştirin ve mikro santrifüj tüpünü daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.Sağım biyopsileri, ortalama 3.17 geçiş potansiyeline sahip nöral kök hücre kültürleri ile sonuçlandı ve dokuz geçişe bile ulaştı. Toplanan hücreler, hem yapışkan tek tabakalar hem de daha nadiren nörosferler olarak büyüdükleri Poli-D-Lizin kaplı kuyucuklara kaplandı. GFAP pozitif olan yeni izole edilmiş hücreler de hareketsiz belirteç ID3 için immüno-pozitifti ve NSE bipolar morfoloji karakteristiğine sahipti.Biyopsi kaynaklı ve postmortem kaynaklı hücrelerin immünositokimyasal karşılaştırması, toplanan hücrelerin profilinin endojen subependimal zon hücrelerine benzer olduğunu gösterdi. Büyüme faktörü, SOX2 hücrelerinde eşzamanlı ve anlamlı bir artışa ve her iki örnekte de çift kortin pozitif nöroblastların azalmasına neden oldu.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Collecting Murine Neural Stem and Oligodendrocyte Progenitor Cells by Cerebrospinal Fluid Liquid Biopsy

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...