Beginnen Sie mit der Zentrifugation der murinen reinen neuronalen Zellsuspension bei 300 G für acht Minuten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Pellet in 80 Mikroliter HBSS mit 0,5 BSA-Lösung. Nach Zugabe des spezifischen Antikörpers werden die Röhrchen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.
Waschen Sie den überschüssigen Antikörper mit HBSS-BSA-Lösung und zentrifugieren Sie ihn. Fügen Sie dem Pellet 20 Mikroliter Antibiotin-Mikrokügelchen hinzu, die in HBSS-BSA resuspendiert wurden. Inkubieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Dann 0,5 Milliliter HBSS mit 0,5%iger BSA-Lösung für jeweils 10 in die sieben Zellen geben. Spülen Sie die Säule mit 0,5 Millilitern HBSS mit 0,5%iger BSA-Lösung. Sobald das Tropfen aufhört, platzieren Sie ein 15-Milliliter-Röhrchen unter der Säule und lassen Sie 0,5 Milliliter Zellsuspension hindurch.
Sammeln Sie das Eluat, das unspezifische neuronale Zellen enthält, und reinigen Sie dann die Säule mit drei Wäschen von 0,5 Millilitern HBSS mit 0,5 % BSA. Entferne nun die Säule vom Magneten und lege sie in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie einen Milliliter HBSS mit 0,5 % BSA hinzu und verwenden Sie den Kolben, um die Zielzellen auszuspülen.
Nach der Zentrifugation und Überstandsaspiration wird das Pellet in 0,5 Milliliter Beschichtungsmedium resuspendiert. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer unter einem Hellfeldmikroskop. Die Zielzellen werden als Positivkontrolle und die unspezifischen Zellen als Negativkontrolle in die vorbereitete 24-Well-Platte gegeben.
12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. LepR-positive Neuronen begannen nach 48 Stunden, Neuriten zu bilden. Bei DIV4 zeigten die axonalen Extensions Fortschritte, während dendritische Prozesse auftraten.
Bei DIV6 waren die Neuronen ausreichend entwickelt. Immunfluoreszenzstudien zeigten, dass keine Gliazellen oder andere nicht-neuronale Zellen beobachtet wurden. Die neuronale Natur der Zellen wurde durch Mikrotubuli-assoziierte Protein-2-Färbung bestätigt.
Bei DIV10 exprimierten 30% der LepR-positiven Zellen POMC. Synaptische Konnektivität und Funktionalität wurden in allgemeinen Kulturen beobachtet, die heterogene hypothalmische neuronale Populationen enthielten.
