Comece preparando uma diluição de 1 a 20 de tinta indiana preta e tampão do sistema de glicerol, depois centrifugue por 10 minutos a 15.000g à temperatura ambiente. Adicione 40 microlitros de solução de tinta e tampão do sistema de glicerol à primeira seção da placa de 384 poços. Agora adicione 25 microlitros de tampão do sistema de glicerol a todos os poços de diluição um e 40 microlitros a todos os poços de diluição dois, três e quatro.
Adicionar 25 microlitros de amostra de glicano extraída aos poços de diluição para diluir as amostras numa proporção um-para-um. Diluir em série cada amostra quatro vezes, transferindo 10 microlitros da diluição um para a diluição dois poços, em seguida, misturar suavemente usando uma pipeta. Repita o processo transferindo 10 microlitros da amostra da diluição dois para a diluição três poços.
Após repetir o processo para a diluição de quatro poços, descarte 10 microlitros dele para que todos os poços tenham um volume final de 40 microlitros. Adicione 40 microlitros de solução de tinta e tampão do sistema de glicerol à placa final. Em seguida, cubra a placa com uma tampa adesiva antes de centrifugar por 10 minutos a 3000g à temperatura ambiente.
Para imprimir as amostras na membrana de nitrocelulose, comece purgando a cabeça de impressão e os capilares várias vezes com tampão do sistema de glicerol. Inicie uma execução de impressão de teste carregando uma placa apenas com o buffer. Para configurar o instrumento para imprimir diretamente do reservatório de buffer limpo, clique em Arquivo, seguido de Novo e escolha Executar impressão.
Escolha o tipo de microplaca e altere as configurações do slide de acordo. Em seguida, altere as configurações de miniarray antes de editar as configurações da propriedade spot. Clique na guia Visão geral para visualizar a placa.
Finalmente, na guia Opções, selecione Usando buffer e calcule o tempo de impressão antes de alocar locais de arquivo para salvar o arquivo. Depois de salvar o local, pressione em Iniciar Execução de Impressão para prosseguir com a execução. Ao imprimir amostras de glicano extraídas, programe o sistema como antes.
Na guia Opções, clique em Usando microplacas de origem. Finalmente, salve o arquivo de grade exclusivo gerado para o microarray impresso para análise downstream. Padrões glicanos definidos também foram incluídos nos microarrays impressos como controles positivos.
O perfil de ligação ao mapa obtido para os padrões glicanos selecionados corresponde às especificidades de epítopos previamente relatadas.
