Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

host cell proteins (hcps) enrichment in monoclonal antibody (mab) drug product

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

Verrijking van gastheerceleiwitten (HCP's) in monoklonaal antilichaam (mAb) geneesmiddel

Verwijder om te beginnen de boven- en onderdoppen van de spinkolom van de commerciële eiwitverrijkingskit en bewaar deze voor toekomstig gebruik. Plaats de niet-afgedekte centrifugekolom in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Centrifugeer de opstelling bij 1000 G en kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 seconden om de bewaaroplossing te verwijderen en weg te gooien.Voeg 200 microliter wasbuffer toe aan de verrijkingskorrels in de centrifugekolom en meng door meerdere keren op en neer te pipetteren. Na het centrifugeren van de centrifugeerkolom zoals eerder gedemonstreerd, gooit u de verzamelde buffer weg. Plaats de onderste dop terug en voeg 200 microliter water toe aan de centrifugekolom voordat u de bovendop terugplaatst.Meng de bereide waterige parelslurry door deze op en neer te pipetteren voordat u 40 microliter ervan overbrengt naar het vooraf bereide monoklonale antilichaammonster. Incubeer de buis door deze twee uur op kamertemperatuur te draaien. Maak vervolgens gaatjes in een fritje van geschikte grootte met een naald van 16 gauge en steek deze in het uiteinde van een punt van 200 microliter.Breng het monster met kralen over naar de voorbereide punt en plaats het in een microcentrifugebuis van twee milliliter met een gat in de bovenkap. Centrifugeer de punt in de buis om de oplossing te verwijderen. Was de kralen door 200 microliter wasbuffer aan de punt toe te voegen.Verwijder de wasbuffer door de punt te centrifugeren in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Was vervolgens de kralen in de punt met 200 microliter water en centrifugeer zoals eerder getoond om het water te verwijderen. Voeg nu 10 microliter elutiebuffer toe aan de punt en laat de korrels er goed in weken door de drijfmest 10 keer op en neer te pipetteren.Breng de tip over in een nieuwe microcentrifugebuis van 0,5 milliliter met een gat in de bovendop en centrifugeer de buis om het ontweken eiwit op te vangen. Voeg 1,5 microliter trypsine-oplossing toe aan het eluent en laat het een nacht op 28 graden verteren. Voeg vervolgens 1,5 microliter van 25 milligram per milliliter Dithiothreitol toe aan het monster en incubeer het gedurende 20 minuten op 90 graden.Incubeer vervolgens het monster met 1,5 microliter 0,25 molair jodoacetamide bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten. Voeg daarna 3,5 microliter 10% trichloorazijnzuur of TFA toe en draai het monster gedurende twee minuten. Centrifugeer het monster bij 14.400 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om SDC en SLS neer te slaan.Vang het aangezuurde supernatans op om te ontzouten. Voeg 50 microliter Buffer B toe aan de GC ontzouttip. Plaats vervolgens de punt in een houder en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 1000 G bij kamertemperatuur.Voeg 50 microliter buffer A toe aan de punt en draai de punt zoals eerder gedemonstreerd. Voeg nu het aangezuurde monster toe aan de punt. Centrifugeer de punt in de houder bij 500 G gedurende zes minuten bij kamertemperatuur.Was vervolgens de punt door er 50 microliter buffer A aan toe te voegen en deze gedurende drie minuten op kamertemperatuur op 500 g te draaien. Eliseer het peptide uit de GC ontzouttip door 50 microliter Buffer B toe te voegen en de tip gedurende drie minuten bij kamertemperatuur in een nieuwe buis bij 500 G te centrifugeren. Droog daarna het opgevangen eluent met behulp van een vacuümconcentrator.Resuspendeer het gedroogde eluent in 30 microliter 0,1% mierenzuuroplossing. Meet de ultraviolette absorptie van de peptidemengsels op 214 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Breng ten slotte 10 microliter van het verteerde monster over in een flesje met vloeistofchromatografiemonster en analyseer één microgram van het monster met behulp van nano LC-MS/MS.De totale ionenchromatogramprofielen van gastheerceleiwitten toonden aan dat in vergelijking met directe vertering, de meeste van de belangrijkste monoklonale antilichaampeptiden werden verminderd of geëlimineerd na de aangetoonde eiwitverrijking in combinatie met een beperkt verteringsprotocol.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Host Cell Proteins (HCPs) Enrichment in Monoclonal Antibody (mAb) Drug Product

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

﻿Preparation of Monoclonal Antibody (mAb) Solutions for Host Cell Protein Enrichment

Bereiding van monoklonale antilichaamoplossingen (mAb) voor eiwitverrijking van gastheercellen