Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

host cell proteins (hcps) enrichment in monoclonal antibody (mab) drug product

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

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होस्ट सेल प्रोटीन (एचसीपी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) ड्रग उत्पाद में संवर्धन

शुरू करने के लिए, वाणिज्यिक प्रोटीन संवर्धन किट के स्पिन स्तंभ से ऊपर और नीचे टोपी को हटा दें और भविष्य में उपयोग के लिए उन लोगों को बनाए रखने. एक दो मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में अनकैप्ड स्पिन स्तंभ रखें. भंडारण समाधान को हटाने और त्यागने के लिए 30 से 60 सेकंड के लिए 1000 ग्राम और कमरे के तापमान पर सेटअप को अपकेंद्रित्र करें।स्पिन कॉलम में संवर्धन मोतियों में धोने बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। स्पिन कॉलम centrifuging के बाद के रूप में पहले से प्रदर्शन किया, एकत्रित बफर त्यागें. नीचे की टोपी को बदलें और शीर्ष टोपी को बदलने से पहले स्पिन कॉलम में 200 माइक्रोलीटर पानी जोड़ें।तैयार जलीय मनका घोल को पहले से तैयार मोनोक्लोनल एंटीबॉडी दवा उत्पाद के नमूने में 40 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने से पहले इसे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। ट्यूब को कमरे के तापमान पर दो घंटे तक घुमाकर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 16 गेज सुई का उपयोग करके उपयुक्त आकार के फ्रिट में छेद करें और इसे 200 माइक्रोलीटर टिप के टिप एंड में डालें।तैयार टिप के लिए मोती के साथ नमूना स्थानांतरण और शीर्ष टोपी में एक छेद के साथ एक दो मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है. समाधान को हटाने के लिए ट्यूब में टिप अपकेंद्रित्र. टिप करने के लिए धोने बफर के 200 microliters जोड़कर मोती धो लें.एक दो मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में टिप अपकेंद्रित्र द्वारा धोने बफर निकालें. अगला, पानी और अपकेंद्रित्र के 200 माइक्रोलीटर के साथ टिप में मोती धो लें के रूप में पहले पानी को हटाने के लिए दिखाया गया है. अब, टिप करने के लिए क्षालन बफर के 10 microliters जोड़ें और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 10 बार घोल pipetting द्वारा उस में मोती भिगोएँ.शीर्ष टोपी में एक छेद के साथ एक नई 0.5 मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में टिप स्थानांतरण और ट्यूब अपकेंद्रित्र eluded प्रोटीन इकट्ठा करने के लिए. एलुएंट में ट्रिप्सिन घोल के 1.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 28 डिग्री पर रात भर पचने दें। फिर, नमूने में 25 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर डाइथियोथ्रेइटोल के 1.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 20 मिनट के लिए 90 डिग्री पर इनक्यूबेट करें।अगला, 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर 0.25 दाढ़ Iodoacetamide के 1.5 microliters के साथ नमूना सेते हैं. उसके बाद, 10% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड या टीएफए के 3.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और दो मिनट के लिए नमूना भंवर करें। एसडीसी और एसएलएस अवक्षेपित करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 14, 400 ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र।डिसाल्टिंग के लिए अम्लीकृत सतह पर तैरनेवाला लीजिए। जीसी डिसाल्टिंग टिप में बफर बी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर टिप को एक धारक में रखें और इसे कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 1000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।टिप में बफर ए के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और टिप को स्पिन करें जैसा कि पहले दिखाया गया था। अब, अम्लीकृत नमूना टिप करने के लिए जोड़ें. कमरे के तापमान पर छह मिनट के लिए 500 ग्राम पर धारक में टिप अपकेंद्रित्र.इसके बाद, इसमें बफर ए के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर टिप को धो लें और इसे कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 500 ग्राम पर घुमाएं। बफर बी के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर और कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 500 ग्राम पर एक नई ट्यूब में टिप को सेंट्रीफ्यूज करके जीसी डिसाल्टिंग टिप से पेप्टाइड को एल्यूट करें। उसके बाद, एक वैक्यूम सांद्रक का उपयोग करके एकत्रित एलुएंट को सुखाएं।0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान के 30 माइक्रोलीटर में सूखे एलुएंट को फिर से निलंबित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 214 नैनोमीटर पर पेप्टाइड मिश्रण के पराबैंगनी अवशोषण को मापें। अंत में, पचाने वाले नमूने के 10 माइक्रोलीटर को तरल क्रोमैटोग्राफी नमूना शीशी में स्थानांतरित करें और नैनो एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके नमूने के एक माइक्रोग्राम का विश्लेषण करें।मेजबान सेल प्रोटीन के कुल आयन क्रोमैटोग्राम प्रोफाइल से पता चला है कि प्रत्यक्ष पाचन की तुलना में, सीमित पाचन प्रोटोकॉल के साथ युग्मित प्रोटीन संवर्धन के बाद अधिकांश प्रमुख मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पेप्टाइड्स या तो कम हो गए थे या समाप्त हो गए थे।

Research

JoVE Journal

Chemistry

Host Cell Proteins (HCPs) Enrichment in Monoclonal Antibody (mAb) Drug Product

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

सीमित पाचन के साथ युग्मित संवर्धन मोती का उपयोग करके मेजबान सेल प्रोटीन विश्लेषण

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

﻿Preparation of Monoclonal Antibody (mAb) Solutions for Host Cell Protein Enrichment

मेजबान सेल प्रोटीन संवर्धन के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) समाधान की तैयारी