Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

host cell proteins (hcps) enrichment in monoclonal antibody (mab) drug product

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

단클론 항체(mAb) 의약품의 숙주 세포 단백질(HCP) 농축

시작하려면 상용 단백질 농축 키트의 스핀 컬럼에서 상단 및 하단 캡을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. 뚜껑을 닫지 않은 스핀 컬럼을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 설정을 1000G 및 실온에서 30-60초 동안 원심분리하여 보관 용액을 제거하고 폐기합니다.스핀 컬럼의 농축 비드에 200마이크로리터의 세척 완충액을 추가하고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다. 앞에서 설명한 대로 스핀 컬럼을 원심분리한 후 수집된 버퍼를 폐기합니다. 하단 캡을 교체하고 상단 캡을 교체하기 전에 스핀 컬럼에 200마이크로리터의 물을 추가합니다.준비된 수성 비드 슬러리를 피펫팅하여 위아래로 혼합한 후 40마이크로리터를 사전 준비된 단클론 항체 의약품 샘플로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 2시간 동안 회전시켜 배양합니다. 그런 다음 16 게이지 바늘을 사용하여 적절한 크기의 프릿에 구멍을 뚫고 200 마이크로 리터 팁의 끝 끝에 삽입합니다.비드가 있는 샘플을 준비된 팁으로 옮기고 상단 캡에 구멍이 있는 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브의 팁을 원심분리하여 용액을 제거합니다. 팁에 200마이크로리터의 세척 완충액을 추가하여 비드를 세척합니다.팁을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 원심분리하여 세척 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 팁의 비드를 물 200마이크로리터로 씻고 앞서 설명한 대로 원심분리하여 물을 제거합니다. 이제 팁에 10마이크로리터의 용출 완충액을 추가하고 슬러리를 위아래로 10회 피펫팅하여 비드를 완전히 담그십시오.상단 캡에 구멍이 있는 새로운 0.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 팁을 옮기고 튜브를 원심분리하여 제거된 단백질을 수집합니다. 용리액에 1.5마이크로리터의 트립신 용액을 넣고 28도에서 밤새 소화시킵니다. 그런 다음 디티오트레이톨 밀리리터당 25밀리그램 1.5마이크로리터를 샘플에 넣고 90도에서 20분 동안 배양합니다.다음으로, 1.5 마이크로 리터의 0.25 몰 요오드 아세트 아미드로 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 20 분 동안 배양합니다. 그런 다음 3.5 마이크로 리터의 10 % 트리클로로 아세트산 또는 TFA를 넣고 샘플을 2 분 동안 소용돌이 치게합니다. 시료를 14, 400G에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 SDC 및 SLS를 침전시킵니다.탈염을 위해 산성화된 상층액을 수집합니다. 50마이크로리터의 버퍼 B를 GC 탈염 팁에 추가합니다. 그런 다음 팁을 홀더에 넣고 실온에서 1000G에서 3분 동안 원심분리합니다.팁에 50마이크로리터의 버퍼 A를 추가하고 앞에서 설명한 대로 팁을 회전시킵니다. 이제 산성화된 샘플을 팁에 추가합니다. 홀더의 팁을 실온에서 500G로 6분 동안 원심분리합니다.그런 다음 50 마이크로 리터의 완충액 A를 첨가하고 실온에서 3 분 동안 500G로 회전시켜 팁을 세척합니다. 50 마이크로리터의 완충액 B를 추가하고 실온에서 3분 동안 500 G의 새 튜브에서 팁을 원심분리하여 GC 탈염 팁에서 펩타이드를 용리합니다. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 수집된 용리액을 건조시킵니다.건조된 용리액을 30 마이크로 리터의 0.1 % 포름산 용액에 다시 현탁시킵니다. 분광광도계를 사용하여 214나노미터에서 펩타이드 혼합물의 자외선 흡광도를 측정합니다. 마지막으로 분해된 시료 10마이크로리터를 액체 크로마토그래피 시료 바이알에 옮기고 나노 LC-MS/MS를 사용하여 시료 1마이크로그램을 분석합니다.숙주 세포 단백질의 총 이온 크로마토그램 프로파일은 직접 분해와 비교했을 때, 대부분의 주요 단클론 항체 펩타이드가 제한된 분해 프로토콜과 결합된 입증된 단백질 농축 후에 감소되거나 제거되었음을 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Host Cell Proteins (HCPs) Enrichment in Monoclonal Antibody (mAb) Drug Product

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

연구

화학

﻿Preparation of Monoclonal Antibody (mAb) Solutions for Host Cell Protein Enrichment

숙주 세포 단백질 농축을 위한 단클론 항체(mAb) 용액 준비