Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

host cell proteins (hcps) enrichment in monoclonal antibody (mab) drug product

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

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Enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em produto farmacêutico de anticorpos monoclonais (mAb)

Para começar, remova as tampas superior e inferior da coluna de rotação do kit comercial de enriquecimento de proteínas e guarde-as para uso futuro. Coloque a coluna de spin sem tampa em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Centrifugar a configuração a 1000 G e temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos para remover e eliminar a solução de armazenamento.Adicione 200 microlitros de tampão de lavagem às esferas de enriquecimento na coluna de rotação e misture pipetando para cima e para baixo várias vezes. Depois de centrifugar a coluna de spin como demonstrado anteriormente, descarte o buffer coletado. Substitua a tampa inferior e adicione 200 microlitros de água à coluna de rotação antes de substituir a tampa superior.Misture a pasta aquosa preparada pipetando-a para cima e para baixo antes de transferir 40 microlitros para a amostra pré-preparada de anticorpo monoclonal do medicamento. Incubar o tubo girando-o à temperatura ambiente durante duas horas. Em seguida, faça furos em uma frita de tamanho adequado usando uma agulha de calibre 16 e insira-a na extremidade da ponta de uma ponta de 200 microlitros.Transfira a amostra com contas para a ponta preparada e coloque-a em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com um furo na tampa superior. Centrifugar a ponta do tubo para remover a solução. Lave as contas adicionando 200 microlitros de tampão de lavagem à ponta.Remova o tampão de lavagem centrifugando a ponta em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Em seguida, lave as contas na ponta com 200 microlitros de água e centrífuga como mostrado anteriormente para remover a água. Agora, adicione 10 microlitros de tampão de eluição à ponta e mergulhe completamente as contas nela, pipetando a lama para cima e para baixo 10 vezes.Transfira a ponta para um novo tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro com um orifício na tampa superior e centrifuga o tubo para coletar a proteína escapada. Adicione 1,5 microlitros de solução de tripsina no eluente e deixe digerir durante a noite a 28 graus. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de 25 miligramas por mililitro de ditiotreitol à amostra e incube-a a 90 graus por 20 minutos.Em seguida, incubar a amostra com 1,5 microlitros de iodoacetamida 0,25 molar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos. Depois disso, adicione 3,5 microlitros de ácido tricloroacético a 10% ou TFA e agite a amostra por dois minutos. Centrifugar a amostra a 14, 400 G durante 10 minutos à temperatura ambiente para precipitar SDC e SLS.Recolher o sobrenadante acidificado para dessalinização. Adicione 50 microlitros de Buffer B à ponta de dessalinização GC. Em seguida, coloque a ponta em um suporte e centrifuja-a a 1000 G por três minutos em temperatura ambiente.Adicione 50 microlitros de Buffer A à ponta e gire a ponta como demonstrado anteriormente. Agora, adicione a amostra acidificada à ponta. Centrifugar a ponta no suporte a 500 G durante seis minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave a ponta adicionando 50 microlitros de Buffer A e girando-a a 500 G por três minutos em temperatura ambiente. Eluir o peptídeo da ponta de dessalinização GC adicionando 50 microlitros de Buffer B e centrifugando a ponta em um novo tubo a 500 G por três minutos à temperatura ambiente. Depois disso, seque o eluente coletado usando um concentrador a vácuo.Ressuspender o eluente seco em 30 microlitros de solução de ácido fórmico a 0,1%. Medir a absorbância ultravioleta das misturas peptídicas a 214 nanômetros usando um espectrofotômetro. Finalmente, transfira 10 microlitros da amostra digerida para um frasco de amostra de cromatografia líquida e analise um micrograma da amostra usando nano LC-MS/MS.Os perfis de cromatograma de íons totais das proteínas da célula hospedeira revelaram que, em comparação com a digestão direta, a maioria dos principais peptídeos de anticorpos monoclonais foi reduzida ou eliminada após o enriquecimento proteico demonstrado juntamente com um protocolo de digestão limitado.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Host Cell Proteins (HCPs) Enrichment in Monoclonal Antibody (mAb) Drug Product

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

Química

﻿Preparation of Monoclonal Antibody (mAb) Solutions for Host Cell Protein Enrichment

Preparação de Soluções de Anticorpo Monoclonal (mAb) para Enriquecimento de Proteínas de Células Hospedeiras