Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

host cell proteins (hcps) enrichment in monoclonal antibody (mab) drug product

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Watch this Scientific Journal Video about Host Cell Proteins HCPs Enrichment in Monoclonal Antibody mAb Drug Product at JoVE.com

Monoklonal Antikor (mAb) İlaç Ürününde Konak Hücre Proteinleri (HCP'ler) Zenginleştirilmesi

Başlamak için, ticari protein zenginleştirme kitinin döndürme kolonundan üst ve alt kapakları çıkarın ve bunları ileride kullanmak üzere saklayın. Kapaksız döndürme kolonunu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Depolama solüsyonunu çıkarmak ve atmak için kurulumu 1000 G ve oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye santrifüjleyin.Sıkma kolonundaki zenginleştirme boncuklarına 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Döndürme kolonunu daha önce gösterildiği gibi santrifüjledikten sonra, toplanan tamponu atın. Alt kapağı değiştirin ve üst kapağı değiştirmeden önce döndürme kolonuna 200 mikrolitre su ekleyin.Hazırlanan sulu boncuk bulamacını, 40 mikrolitresini önceden hazırlanmış monoklonal antikor ilaç ürünü örneğine aktarmadan önce yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında iki saat döndürerek inkübe edin. Ardından, 16 gauge iğne kullanarak uygun büyüklükte bir fritte delikler açın ve 200 mikrolitrelik bir ucun uç ucuna yerleştirin.Numuneyi boncuklarla hazırlanan uca aktarın ve üst kapağında bir delik bulunan iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Çözeltiyi çıkarmak için tüpün içindeki ucu santrifüjleyin. Ucuna 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın.Ucu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde santrifüjleyerek yıkama tamponunu çıkarın. Ardından, uçtaki boncukları 200 mikrolitre su ile yıkayın ve suyu çıkarmak için daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin. Şimdi, uca 10 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve bulamacı 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek içindeki boncukları iyice ıslatın.Ucu, üst kapağında bir delik bulunan yeni bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kaçan proteini toplamak için tüpü santrifüjleyin. Eluentin içine 1.5 mikrolitre tripsin çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 28 derecede sindirilmesine izin verin. Daha sonra, numuneye mililitre başına 1.5 mikrolitre 25 miligram Dithiothreitol ekleyin ve 20 dakika boyunca 90 derecede inkübe edin.Daha sonra, numuneyi 1.5 mikrolitre 0.25 molar İyodoasetamid ile oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, 3.5 mikrolitre% 10 Trikloroasetik asit veya TFA ekleyin ve numuneyi iki dakika boyunca vorteksleyin. SDC ve SLS'yi çökeltmek için numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.400 G'de santrifüjleyin.Tuzdan arındırmak için asitlendirilmiş süpernatanı toplayın. GC tuz giderme ucuna 50 mikrolitre Tampon B ekleyin. Ardından ucu bir tutucuya yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin.Uca 50 mikrolitre Tampon A ekleyin ve ucu daha önce gösterildiği gibi döndürün. Şimdi, asitlenmiş numuneyi uca ekleyin. Tutucudaki ucu oda sıcaklığında altı dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.Bunu takiben, üzerine 50 mikrolitre Tampon A ekleyerek ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 G'de döndürerek ucu yıkayın. 50 mikrolitre Tampon B ekleyerek ve ucu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 G'de yeni bir tüpte santrifüjleyerek peptidi GC tuz giderme ucundan çıkarın. Bundan sonra, toplanan eluenti bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.Kurutulmuş eluenti 30 mikrolitre% 0.1 formik asit çözeltisi içinde tekrar süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak peptit karışımlarının ultraviyole absorbansını 214 nanometrede ölçün. Son olarak, sindirilmiş numunenin 10 mikrolitresini bir sıvı kromatografi numune şişesine aktarın ve nano LC-MS/MS kullanarak numunenin bir mikrogramını analiz edin.Konak hücre proteinlerinin toplam iyon kromatogram profilleri, doğrudan sindirimle karşılaştırıldığında, majör monoklonal antikor peptitlerinin çoğunun, sınırlı sindirim protokolü ile birlikte gösterilen protein zenginleştirmesinden sonra ya azaldığını ya da elimine edildiğini ortaya koydu.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Host Cell Proteins (HCPs) Enrichment in Monoclonal Antibody (mAb) Drug Product

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

﻿Preparation of Monoclonal Antibody (mAb) Solutions for Host Cell Protein Enrichment

Konak Hücre Protein Zenginleştirmesi için Monoklonal Antikor (mAb) Çözeltilerinin Hazırlanması