Name: Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00
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two-tiered expansion of human mesenchymal stem cells from 5-liter to 15-liter bioreactors and automated cell formulation from a 15-liter bioreactor

Production en système fermé de cellules adhérentes à base de microtransporteurs solubles

The CGT industry has witnessed an exponential expansion over the past two decades. The evolution of next-generation medicines is anticipated to treat and cure numerous refractory diseases1. Since the first Food and Drug Administration (FDA) approval of a CGT product, Kymriah, in 2017, CGT-related research and development in the world has continued to grow at a fast rate, with the FDA seeing active investigational new drug applications for CGT increased to 500 in 20182. It had been predicted that the number of approvals of CGT products will likely be 54-74 in the United States by 20302.
While the rapid growth in CGT research and innovation is exciting, there is still a large technological gap between lab research and industrial-scale manufacturing that could deliver these promising medicines to reach as many patients as needed at affordable costs. The current processes adopted for these clinical trials were established in labs for small-scale experiments, and significant efforts are needed to improve and innovate on CGT manufacturing3. There are many types of CGT products, most of them based on live cells, which can be allogenic, autologous, engineered, or natural. These living drugs are much more complex than small molecular entities or biologics, hence making large-scale manufacturing a significant challenge4,5,6. In this work, we demonstrate a large-scale cell production protocol for three anchorage-dependent cells that are widely applied in CGTs. These include human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), which have been used for cell-based therapy, and HEK293T cells and Vero cells, both of which are used to produce viruses for the genetic engineering of the final therapeutic cell product. Anchorage-dependent cells are commonly cultured on planar systems, which require manual processing. However, manual culture methods require a significant amount of labor and are prone to contamination, which can compromise the quality of the end product. Furthermore, there is no in-line process control, leading to substantial variability in quality between batches7. Taking stem cell therapy as an example, with a promising pipeline of over 200 stem-cell therapy candidates, it is estimated that 300 trillion hMSCs would be needed per year to meet the demands of clinical applications8. Hence, the large-scale manufacturing of therapeutic cells has become a prerequisite to perform these therapeutic interventions with such a high cell demand9.
To preclude the setbacks of planar systems, efforts have been made in developing large-scale manufacturing processes in stirred-tank bioreactors with conventional non-dissolvable microcarriers10,11,12,13, but these suffer from complicated preparation procedures and low cell-harvesting efficiency14. Recently, we have innovated a dissolvable microcarrier for stem cell expansion, aiming to circumvent the challenges of cell harvesting from conventional non-dissolvable commercial microcarriers15. This novel, commercially available GMP-grade 3D dissolvable porous microcarrier, 3D TableTrix, has shown great potential for large-scale cell production. Indeed, 3D culture based on these porous microcarriers could potentially recreate favorable biomimetic microenvironments to promote cell adhesion, proliferation, migration, and activation16. The porous structures and interconnected pore networks of microcarriers could create a larger cell adhesion area and promote the exchange of oxygen, nutrients, and metabolites, thus creating an optimal substrate for in vitro cell expansion17. The high porosity of these GMP-grade 3D dissolvable porous microcarriers enables large-scale expansion of hMSCs, and the ability for the cells to be fully dissolved allows for the efficient harvesting of these expanded cells18. It is also a GMP-grade product and has been registered as a pharmaceutical excipient with the Chinese Center for Drug Evaluation (filing numbers: F20210000003 and F20200000496)19 and the FDA of the United States (FDA, USA; Drug Master File number: 35481)20.
Here, we illustrate an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) system18 using these dispersible and dissolvable porous microcarriers for hMSC, HEK293T cell, and Vero cell expansion. We achieved a successful two-tiered expansion of hMSCs (128 cumulative fold expansion in 9 days) from a 5 L bioreactor to a 15 L bioreactor and finally obtained up to 1.1 x 1010 hMSCs from a single batch of production. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Furthermore, we assessed the quality of hMSC products to confirm compliance. We also demonstrated the application of these dissolvable microcarriers for the scaled-up production of two other types of anchorage cells, HEK293T cells and Vero cells, that are extensively applied in the CGT industry. The peak cell density of HEK293T cells reached 1.68 x 107 cells/mL, whereas the peak density of Vero cells reached 1.08 x 107 cells/mL. The ACISCP system could be adapted to culture a variety of adherent cells, and it could potentially become a powerful platform contributing to expediting the industrialization of CGT.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la fabrication de thérapies cellulaires avec des microtransporteurs solubles 

Production de cellules à grande échelle à base de microporteurs poreux solubles de qualité GMP

The cell and gene therapy industry has witnessed an exponential expansion over the past two decades. However, a large technological gap exists between lab research and industrial skill manufacturing. Compliant with regulatory policies, and to meet the green demands of the CGT industry, automated closed systems have been adopted to produce cell therapeutics.For adherent cells, cultivation using microcarriers in scalable stirred-tank bioreactors, is a promising method. Conventionally, commercialized microcarriers are non-desirable. Cell harvesting using trypsinization and the saving out microcarriers by size is not only inefficient and challenging, but also impacts cell quality and causes safety concerns.In this study, we have successfully achieved large-scale cell production based on GMP-grade 3D TableTrix dissolvable microcarriers in an automated and closed system. Over 11 billion human mesenchymal stem cells were yield in a two-stage expansion within nine days. We also demonstrated high density culture of HEK293T cells and Vero cells, in which both densities reached above 10 million cells per milliliter.This advanced biomanufacturing platform allows adherence cells to be effectively expanded and completely harvested in an automated and closed manner. Our protocol offers an opportunity to enhance production efficiency and refine quality control at industrial-scale manufacturing of CGT products.

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Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor  

Expansion à deux niveaux de cellules souches mésenchymateuses humaines de bioréacteurs de 5 litres à 15 litres et formulation cellulaire automatisée à partir d’un bioréacteur de 15 litres

À partir de la cuve du bioréacteur agitée, arrêtez temporairement le contrôle de la température, du pH et de l’oxygène dissous sur le contrôleur du bioréacteur et distribuez complètement tout le PBS de la cuve dans la bouteille de déchets. Soudez au module de filtration à usage unique à un orifice du sac de rangement à usage unique de 10 litres. Filtrez et transférez le milieu MSC complet sans sérum dans le sac de stockage.Réglez la pompe à une vitesse à 300 tr/min. Et distribuez un litre de milieu du sac d’alimentation dans le récipient. Arrêtez la pompe.Et recommencez la température pH et dissoute à l’OD à nouveau, selon les instructions du fabricant. Scellez et débranchez le tube reliant le retour d’information au tube d’alimentation. Soudez le tube de la bouteille de micro-supports dispersés au tube d’alimentation.Et pompez tout le contenu de la bouteille dans le récipient. Ensuite, remettez en suspension 2,5 fois 10 aux huit HMC dans un milieu sans sérum et transférez-les dans le flacon vide contenant précédemment la suspension de micro-support. Ajoutez le milieu sans sérum à 500 millilitres au total à l’intérieur du flacon et mélangez la suspension cellulaire.Pompez tout le contenu de la bouteille dans le récipient. Scellez et débranchez le tube reliant la bouteille au tube d’alimentation, puis soudez le sac d’alimentation. Ajustez les paramètres d’agitation sur le contrôleur pour initier l’inoculation des cellules aux micro-transporteurs.Et mettre en place un régime automatisé de suppléments et d’échanges de supports. Soudez les sacs d’échantillonnage jetables au tube d’échantillonnage. Et collectez des échantillons aux moments souhaités.Au moment de la récolte des cellules sur le contrôleur, réglez la vitesse d’agitation sur zéro pour que les micro-transporteurs se déposent. Et distribuer le surnageant dans le régime alimentaire, en laissant environ un litre de suspension de culture dans le récipient. Soudez le sac contenant 50 millilitres de solution digestive fraîchement préparée à 500 millilitres d’HBSS pour dilution.Et pompez toute la solution dans le récipient, via le tube d’alimentation. Réglez la vitesse d’agitation entre 40 et 45 tr/min pour dissoudre les micro-transporteurs. Une fois que les micro-transporteurs se sont dissous dans les 40 à 60 minutes, soudez le sac de stockage jetable de trois litres au tube de récolte et pompez complètement la suspension cellulaire.Allumez le système de traitement des cellules pendant la récolte des cellules. Et installez un kit de traitement des cellules jetables sur l’instrument, selon les instructions du fabricant. Soudez les sacs de suspension cellulaire, de tampon de lavage et de milieu de culture au kit.Entrez les paramètres de fonctionnement et démarrez le processus automatisé de lavage et de remise en suspension. Prélever l’échantillon de cellules dans la chambre de la centrifugeuse comme indiqué par les systèmes de traitement cellulaire pour le calcul de la densité cellulaire. Après le comptage, réajustez la densité cellulaire à deux fois 10 à six cellules par millilitre, en utilisant le milieu complet sans sérum.Pour le processus de formulation cellulaire dans un bioréacteur de 15 litres, utilisez un tampon de formulation pour remettre en suspension les cellules récoltées. Soudez 250 millilitres de cellules remises en suspension au remplissage des cellules. Assemblez le kit de consommables jetables de remplissage et de finition sur le système de remplissage de cellules.Et allumez le système de pré-refroidissement, en suivant les instructions du fabricant avant que les cellules ne soient à nouveau suspendues. Suivez les instructions sur le système et réglez-le pour qu’il remplisse 30 millilitres par sac avec un total de 20 sacs par ensemble. Soudez le nouvel ensemble de 20 sacs de cryoconservation au kit de consommables jetables de remplissage et de finition et répétez le remplissage et la finition jusqu’à ce que toutes les cellules soient aliquotes.Pour les CSMh, une expansion cumulée de 128 fois a été obtenue avec une viabilité cellulaire supérieure à 90 %L’apport en glucose a montré une corrélation négative avec l’expansion cellulaire, montrant un métabolisme associé à une croissance cellulaire saine. Les CSM fraîchement récoltées conservent des marqueurs phénotypiques classiques avec plus de 95 % d’expression pour les marqueurs positifs et moins de 2 % pour les marqueurs négatifs. Les cellules cryo-conservées ont montré une bonne adhérence, un comportement d’expansion normal et une forme de fuseau typique avec une croissance en spirale après décongélation et replacage sur des flacons 2D.De plus, les cellules ont également conservé leur capacité à se différencier en lignées ostéogéniques, adipogéniques et chondrogéniques. Cette plate-forme peut également être adoptée pour cultiver d’autres cellules dépendantes de l’ancrage, telles que les cellules HEK293T et Vero. Après le processus de transfert B2B dans le bioréacteur de 15 litres, les cellules HEK293T ont atteint une concentration cellulaire maximale de 1,68 fois 10 des sept cellules par millilitre.Alors que les cellules Vero ont atteint une concentration de 1,08 fois 10 aux sept cellules. Les deux types de cellules ont maintenu une viabilité élevée.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...