Name: Chirurgie de la fenêtre pancréatique murine
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00
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murine pancreatic window surgery

Imagerie pancréatique murine à l’aide d’une fenêtre stabilisée implantée

Benign and malignant pancreatic diseases are potentially life-threatening, with considerable gaps in the understanding of their pathophysiology. Pancreatitis-inflammation of the pancreas-is the third major cause of gastrointestinal disease-related hospital admissions and readmissions in the US and is associated with substantial morbidity, mortality, and socioeconomic burden1. Ranked as the third leading cause of cancer-related death2, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) accounts for most pancreatic malignancies3 and portends a poor 5-year survival rate of only 11%2. The leading cause of cancer-related mortality in PDAC is overwhelming metastatic burden. Unfortunately, most patients present with metastatic disease. Therefore, understanding the dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need in the field of cancer research.
The mechanisms underpinning inflammation and the metastatic cascade of the pancreas are poorly understood. A major contributor to this gap in knowledge is the inability to observe pancreatic cellular dynamics in vivo. Direct observation of these cellular dynamics promises to unveil critical targets to leverage and improve the diagnosis and treatment of those with pancreatic disease.
Intravital imaging (IVI) is a microscopy technique that allows researchers to visualize and study biological processes in living animals in real time. IVI allows high-resolution, direct visualization of intracellular and microenvironmental dynamics in vivo and within the native environment of the biological process in question. Therefore, IVI allows in vivo observation of healthy and pathologic processes.
Contemporary whole-body imaging modalities such as MRI, PET, and CT offer excellent views of entire organs and can reveal pathologies, even before the onset of clinical symptoms4. They are unable, however, to attain single-cell resolution or reveal the earliest stages of disease-pancreatitis or malignancy.
Previous research has used single-cell resolution IVI to observe benign and malignant diseases of skin5,6, breast7, lung8, liver9, brain10, and pancreatic tumors11, leading to insights into mechanisms of disease progression12. However, the murine pancreas poses significant obstacles to achieving single-cell resolution using IVI, primarily due to its deep visceral location and high compliance. Moreover, it is a branched, diffusely distributed organ within the mesentery that connects to the spleen, small intestine, and stomach, making it challenging to access. The tissue is also highly sensitive to motion caused by adjacent peristalsis and respiration. Minimizing movement of the pancreas is essential for single-cell resolution microscopy, as motion artifacts of even a few microns can blur and distort images, making tracking the dynamics of individual cells impossible13.
To perform IVI, an abdominal imaging window (AIW) must be surgically implanted9,11. To implant the AIW surgically, a metal window frame is sutured into the abdominal wall. Afterward, the organ of interest is attached to the frame using cyanoacrylate adhesive. While this is sufficient for some rigid internal organs (e.g., liver, spleen, rigid tumors), attempts at imaging the healthy murine pancreas are compromised by suboptimal lateral and axial stability due to the tissue&#39;s compliant texture and complex architecture14. To address this limitation, Park et al.14 developed an imaging window specifically designed for the healthy pancreas. This Pancreas Imaging Window (PIW) minimizes the influence of intestinal movement and breathing by incorporating a horizontal metal shelf within the window frame, just below the coverslip, stabilizing the tissue and maintaining its contact with the cover glass. While the PIW offers increased lateral stability, we found that this window still demonstrates axial drift and additionally prevents the imaging of large solid tumors due to the narrow gap between the metal shelf and coverslip15.
To address these limitations, we developed the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), an implantable imaging window capable of achieving stable long-term imaging of both the healthy and diseased pancreas (Figure 1)15. Here, we provide a comprehensive protocol for the surgical procedure used to implant the SWIP. Although the primary objective was to study the dynamic mechanisms involved in metastasis, this method can also be utilized to explore various aspects of pancreas biology and pathology.

Pleins feux sur l’auteur : Révolutionner la compréhension des maladies du pancréas grâce à l’imagerie intravitale avancée 

Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

Employing high-resolution intravital imaging and an improved method of pancreas stabilization, we aim to enhance comprehension of the physiological dynamics of pancreatic adenocarcinoma, pancreatitis, and the healthy pancreas. This approach makes it possible to address gaps in the pathophysiological understanding, potentially advancing treatment strategies for these high-risk conditions. Single-cell resolution intravital imaging has illuminated the physiology and mechanisms of disease progression in various tissues.However, the pancreas presents unique challenges due to its deep placement, compliance, and susceptibility to motion artifacts, hindering effective access for observation for both benign and malignant conditions. Our SWIP technique enhances murine pancreas stabilization compared to prior abdominal imaging windows. The uniquely designed frame features etched lines for the use of micro-cartography, which enables consistent region relocalization across multiple imaging sessions.This facilitates the measurement of subcellular dynamics over days, providing valuable insights. The SWIP protocol enables stable, high-resolution, single-cell intravital imaging of the murine pancreas in normal and diseased states. It's especially beneficial for prolonged 3D and 4D imaging, offering insights into cellular interactions and disease mechanisms.Invaluable for unraveling pancreatic physiology and pathology, this technique visualizes single cells and their context in vivo.

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Chirurgie de la fenêtre pancréatique murine

Commencez par positionner une souris anesthésiée sur son côté droit sur un support chirurgical chauffé pour exposer son abdomen gauche. Ancrez l’extrémité avant et les membres postérieurs de la souris avec du ruban adhésif en papier, en assurant la visibilité de la rate. Ensuite, désinfectez la peau au site chirurgical en appliquant généreusement un antiseptique.Confirmez que la souris est complètement anesthésiée en lui administrant un pincement des orteils. À l’aide d’une pince, soulevez la peau de la partie supérieure gauche de l’abdomen et faites une incision circulaire de 10 millimètres dans la peau et la couche musculaire à l’aide de ciseaux castroviejo. Localisez le pancréas attaché à la rate pour déterminer la direction dans laquelle le point de croix doit être placé.Utilisez une suture en soie 5/0 pour placer le premier point dans la couche musculaire à l’endroit identifié. Fixez l’extrémité avec trois à cinq nœuds. Continuez à coudre directement sur l’incision.Ensuite, coupez et laissez une queue d’environ cinq centimètres. Répétez la couture, cette fois perpendiculairement à la maille d’origine. Ensuite, soulevez et positionnez délicatement le pancréas sur le point de croix.Placez un point de fil de sac à main à environ un millimètre du trou, en entrelaçant la couche de peau et de muscle. Positionnez le cadre de la fenêtre de manière à ce que les bords de l’incision circulaire soient situés dans la rainure de la fenêtre. Maintenant, fixez la fenêtre implantée en attachant fermement la soie 5/0.Chargez 100 microlitres d’adhésif cyanoacrylate liquide dans une seringue de 10 millimètres. Appliquez un délicat jet d’air comprimé vers le tissu pendant environ 10 secondes pour le sécher. À l’aide d’une pince, saisissez le cadre de la fenêtre par son bord extérieur et soulevez-le avec précaution pour assurer la séparation du pancréas de la base du cadre de la fenêtre.Distribuez une fine couche d’adhésif cyanoacrylate liquide le long de l’évidement de la fenêtre, en évitant le tissu pancréatique. Ensuite, utilisez des ramasseurs à vide pour soulever la lamelle de cinq millimètres. Positionnez doucement la lamelle de recouvrement au centre du cadre de la fenêtre optique et maintenez une légère pression pendant environ 25 secondes pour permettre à l’adhésif de durcir.À l’aide d’une pince, détachez la lamelle de protection des ramasseurs à vide. Ensuite, serrez les sutures au point de croix pour fixer le pancréas à la lamelle et coupez les extrémités des sutures. Enfin, retirez le ruban adhésif de la souris.Éteignez le vaporisateur d’isoflurane et placez la souris dans une cage propre. Une augmentation de la stabilité latérale et axiale du tissu pancréatique a été observée après la période de décantation. L’imagerie avec le SWIP a montré des niveaux de dérive inférieurs par rapport aux fenêtres d’imagerie abdominale et pancréatique.Une imagerie en série du pancréas murin a été réalisée après un traitement à la céruléine. Le déplacement des lobules a été observé après deux jours consécutifs. Le SWIP peut également être utilisé pour l’imagerie à long terme, permettant la visualisation et la quantification de la motilité vacuole.Par exemple, la vitesse moyenne des vacuoles dans le pancréas murin a augmenté d’environ 10 % après le traitement à la céruléine, par rapport au PBS. Le traitement par céruléine a également augmenté la fréquence moyenne de rotation des structures subcellulaires de 10 %Cependant, il n’y avait pas de différence significative dans la vitesse nette, la directionnalité ou la distance cumulée entre les traitements. SWIP permet de visualiser et de capturer la migration des cellules tumorales.La migration collective des cellules tumorales a été observée sur de courtes périodes. La migration de cellules tumorales et de macrophages a également été observée.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Pancreatic Window Surgery

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...