Name: in-vivo centrifugation of drosophila embryos
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

Ringraziamo Susan Gerbi, Heidi Smith e David Lambert per la fornitura di materiale per testare in vivo sui centrifugazione Sciara coprophila e Ilyanassa obsoleta, rispettivamente. Ringraziamo i membri del laboratorio Welte per commenti sulla tecnica e manoscritto. Sviluppo e la raffinatezza del test in vivo centrifugazione è stato sostenuto da NIGMS concedere GM64687 a MAW. Le immagini mostrate in fig. 1 e fig. 5E, F sono stati precedentemente pubblicato 2 e sono ristampato qui con il permesso.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici Assicurarsi che la concentrazione di agar è abbastanza alta. Se è troppo basso, l&#39;agar-agar si disintegrerà durante la centrifugazione, e gli embrioni saranno scoppiare o essere orientati in modo casuale. Se la concentrazione di agar è solo un po &#39;troppo basso o se l&#39;agar è bagnato (rimozione sufficientemente secchi o insufficiente di TSS eccesso al punto 4.3), gli embrioni galleggerà dai loro buchi durante la centrifugazione e diventare impropriamente oriented. Se l&#39;agar è versato troppo sottilmente, sarà anche il collasso o crack durante la centrifugazione. Assicurarsi che gli embrioni non hanno superato le fasi cellularization. In caso contrario, la separazione di organelli non funziona (Fig. 5C) dal organelli sarà sequestrato all&#39;interno di migliaia di singole cellule. Nei giovani embrioni allo stadio di una cellula, organuli sono liberi di migrare grandi distanze e si accumulano in base alla loro densità caratteristica. Per evitare di analizzare gli embrioni che sono troppo vecchio, assicurarsi di (i) comportare un pre-raccolta per permettere alle femmine di deporre le uova vecchie (passo 2,4), (ii) raccogliere embrioni per 3 ore o meno (punto 2.5), (iii) visivamente selezionare gli embrioni prima di fasi cellularization per includerle in agar (punto 4.2), (iv) tenere incorporando poco tempo per prevenire lo sviluppo fino alla fine di cellularization (punto 4.6), e (v) scartare gli embrioni che non hanno strato correttamente (passo 5.6) . Non lesinare sul tempo di centrifugazione. Anche se alcuni degli embrioni mostrerà stratificazione piacevole anche dopo soli 10 minuti di centrifugazione, la separazione è incoerente dall&#39;embrione embrione. 30 giri min dare risultati altamente coerenti. Inoltre, più lungo è il tempo di centrifugazione, più a lungo i livelli sono stabili dopo la centrifugazione è terminata. Questo è importante per quelle applicazioni in cui ci vuole tempo per elaborare gli embrioni prima di essere utilizzati (per esempio, se hanno bisogno di essere trattati per esperimenti di trapianto o montato per l&#39;analisi confocale). Eventuali modifiche Raccolta degli ovuli e corion rimozione Molti protocolli differenti esistono per i punti 2 e 3 1, 3, 9, e funzionerà così come quelli descritti qui fino a quando gli embrioni utilizzati sono giovani, resa uovo è alto, e la frazione di mis- embrioni in scena è ridotta al minimo. Antero-posteriore allineamento Il protocollo orienta tutti gli embrioni tale che l&#39;estremità posteriore è sepolto nel agar e la fine anteriore è alto (Fig. 3). Questo orientamento è un bene per coerenza, in modo che sia possibile utilizzare il micropilo come punto di riferimento che finiscono rivolta verso l&#39;alto durante la centrifugazione (Fig. 1, 5). Tuttavia, con la pratica, è facile individuare l&#39;orientamento degli embrioni centrifugati dalla comparsa distinte del lipidi goccia e strati tuorlo da campo chiaro microscopia. Allora diventa possibile montare sia con gli embrioni finiscono, questa flessibilità accelera il processo di montaggio. Centrifugazione Unoriented L&#39;aspetto più-in termini di tempo e tecnicamente impegnativo del protocollo è di montaggio degli embrioni in agar (punto 4). Si richiede di toccare ogni embrione due volte (una volta per inserirlo nel foro e una volta per recuperarlo dopo la centrifugazione). In alternativa, si può trasferire gli embrioni a passo 4,1 in provette da microcentrifuga pieno di TSS. Quando questi tubi vengono centrifugati in una microcentrifuga (13.000 giri al minuto, 10-30 min), gli embrioni anche tipicamente strato di ben 10-13. Questa variante permette di processare centinaia di embrioni, allo stesso tempo molto rapidamente. Tuttavia, la stratificazione non è così consistente, una parte degli embrioni non si sviluppano strati distinti, nonostante le forze di centrifugazione molto più alta (~ 16.000 g) che applicato il protocollo di cui sopra. Più impegnativo è il fatto che l&#39;orientamento degli embrioni è variabile, e si può osservare la separazione a vari angoli rispetto all&#39;asse principale embrione. Questa variabilità richiede lo sperimentatore di risolvere dopo la centrifugazione come un embrione particolare è stato organizzato nella provetta da centrifuga. Con l&#39;uso del tuorlo autofluorescenza come marker per la maggior parte alta densità dell&#39;embrione, questo è spesso possibile, anche se richiede molta pratica e giudizio di farlo in modo affidabile. Se ci sono embrioni sufficiente nel campione, si può essere in grado di risolvere quei casi in cui gli embrioni capitato di essere disposti come in fig. 1. Centrifugazione degli embrioni nel loro guscio dell&#39;uovo E &#39;possibile incorporare gli embrioni in agar per il passaggio 4 senza rimuovere il corion primi 2. In questo approccio, gli embrioni sulla piastra di raccolta sono coperti con olio alocarburi invece del 50% di candeggina al punto 3.2 (alocarburi trasforma il traslucido corion). Embrioni di stadi appropriati vengono selezionati e trasferito in una nuova piastra di agar con pinzette; afferrando solo i filamenti d&#39;uovo con le pinze, danniil corretto embrione è evitato. Gli embrioni sono incorporati come nel passo 4,4 per 4,8, con i filamenti d&#39;uovo anteriore attaccare fuori dal buco nel agar. Il guscio d&#39;uovo viene rimosso da un trattamento di candeggina al 50% dopo che gli embrioni sono stati centrifugati e scavato nella agar come al punto 5.4. Centrifugazione, alla presenza del guscio dell&#39;uovo può migliorare il tasso di devitellinization dopo fissazione (passo 6.2), ma la selezione degli stadi corretti per centrifugazione (passo 4.2) è più impegnativo. Applicazioni Centrifugazione embrione è particolarmente utile per gli esperimenti di colocalizzazione, cioè, per verificare se una particolare proteina localizza a un certo organello importante. Per esempio, la proteina Klar è presente sui primi gocce lipidiche embrionale, ma questa localizzazione è difficile da dimostrare in embrioni intatto. In parte, ciò è dovuto sia puncta Klar e gocce lipidiche sono abbondanti nella periferia embrione 10, rendendo colocalizzazione spurie difficili da escludere. Tuttavia, centrifugazione concentra gocce lipidiche in uno strato distinto, e, quindi, colocalizzazione con segnale Klar diventa evidente 10. Un&#39;analisi simile è dimostrato in modo inequivocabile la localizzazione di altre proteine ​​di gocce lipidiche 8, 13-15, con esempi sorprendente come alcuni istoni 2 e nei casi in cui una proteina è presente ubiquitariamente, ma arricchito di gocce lipidiche 8. Come gli embrioni possono essere selezionate visivamente da stadio di sviluppo (punto 4.2), è anche possibile rilevare l&#39;assunzione di proteine ​​evolutivamente regolata a gocce lipidiche 8, 15. Test per colocalizzazione con gocce lipidiche è particolarmente semplice, visto che si accumulano gocce lipidiche in una visivamente distinte &quot;cap&quot;, in modo che nessun ulteriore marker o macchia è necessario per identificare questo strato. Infatti, a causa della sua facilità e risultati visivi potenzialmente sorprendenti (Fig. 1, Fig. 5. D, E), il nostro laboratorio utilizza questa tecnica ormai di routine come un primo test se una proteina è localizzata per il candidato gocce lipidiche. In linea di principio, gli studi di colocalizzazione simile dovrebbe lavorare per il organelli altri mostrato in fig. 1, e probabilmente per gli altri (compresi i parassiti intracellulari), la cui distribuzione negli embrioni centrifugati deve ancora essere documentati. Dal centrifugazione concentra organelli in bande strette, facilita l&#39;isolamento di una frazione arricchita in questi organelli. Questo approccio è già stato utilizzato per il recupero gocce lipidiche per il trapianto in embrioni di donatori 2. Può anche essere possibile analizzare biochimicamente la frazione arricchito (ad esempio, tagliando strati off embrioni dopo la fissazione 15). Il metodo descritto qui ha applicazioni che vanno oltre gli embrioni di Drosophila, la centrifugazione può essere utilizzata per stratificare le uova di diverse specie (tra cui le rane, nematodi, tunicati, anellidi, ricci di mare, molluschi e Cnidari) 16. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato il protocollo di cui sopra per gli embrioni di Musca domestica mosca 2 e hanno impiegato centrifugazione unoriented per l&#39;analisi di embrioni dal moscerino fungo Sciara coprophila 17 e la lumaca Ilyanassa obsoleta 17. Infine, questo metodo non è limitato agli embrioni: centrifugazione può anche essere utile per stratificare altre cellule di grandi dimensioni, come gli ovociti (ad esempio, in Drosophila 2, 18 e l&#39;euforbia bug Oncopeltus fasciatus 17). Per diversi esemplari, le condizioni di centrifugazione esatti devono essere ottimizzati: per esempio, 10 minuti a 3000 g è sufficiente per stratificare efficacemente embrioni di Musca domestica 2, e se centrifugati molto più lungo, gli embrioni tendono a rompersi durante la fissazione e immunocolorazione.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Una strategia importante per purificare e isolare i diversi tipi di organelli intracellulari è quello di separare gli uni dagli altri sulla base di differenze di densità di galleggiamento. Tuttavia, quando le cellule sono interrotte prima della centrifugazione, proteine ​​e organelli in questo non-native ambiente spesso impropriamente unirsi tra di loro. Qui si descrive un metodo per separare gli organelli dalla densità in intatto, embrioni vivi Drosophila. Embrioni precoci prima cellularization vengono raccolte dalle gabbie della popolazione, e la loro gusci d&#39;uovo esterni vengono rimossi dal trattamento con il 50% di candeggina. Gli embrioni vengono poi trasferiti ad una piastra di agar piccole e inserito, estremità posteriore prima in piccoli fori verticali in agar. Le piastre contenenti embrioni incorporati vengono centrifugati per 30 minuti a 3000g. L&#39;agar supporta gli embrioni e li mantiene in un orientamento definito. In seguito, gli embrioni sono scavate nella agar con un ago smussato. Centrifugazione separa organuli principali in strati distinti, una stratificazione facilmente visibile da campo chiaro microscopia. Un certo numero di marcatori fluorescenti sono disponibili per confermare stratificazione successo in embrioni vivi. Proteine ​​associate con alcuni organelli sarà arricchita da uno strato particolare, dimostrando colocalizzazione. Singoli strati possono essere recuperati per l&#39;analisi biochimiche o il trapianto in uova donatore. Questa tecnica è applicabile per la separazione degli organelli in altre cellule di grandi dimensioni, comprese le uova e ovociti di specie diverse.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Descriviamo un metodo per separare gli organelli dalla densità del vivere<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni. Gli embrioni sono inseriti in agar e centrifugato. Questa tecnica produce separazione riproducibile organuli principali lungo l&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione. Questo metodo facilita esperimenti colocalizzazione e rendimenti frazioni organello per analisi biochimiche e di esperimenti di trapianto.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

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