Name: in-vivo centrifugation of drosophila embryos
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

Мы благодарим Сьюзен Герби, Хайди Смит и Дэвид Ламберт на поставку материала для тестирования в естественных условиях центрифугирования на Sciara coprophila и Ilyanassa obsoleta, соответственно. Мы благодарим членов Вельте лабораторию для комментариев по технике и рукописи. Развитие и совершенствование в естественных условиях центрифугирования анализа была поддержана NIGMS грант GM64687 к MAW. Изображений показаны на рис. 1 и рис. 5E, F ранее были опубликованы 2 и перепечатана здесь с разрешения.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Критические шаги Убедитесь, что агар концентрация достаточно высока. Если она слишком низка, агар распадется во время центрифугирования, и эмбрионы лопнет или быть ориентированы случайным образом. Если агар концентрация чуть-чуть слишком низкая или, если агар мокрой (недостаточно сушеные или недостаточное удаление лишней TSS в шаге 4.3), эмбрионы будут плавать из своих нор во время центрифугирования и стать неправильно ориентирована. Если агара заливают слишком тонко, она также будет свернуть или трещину во время центрифугирования. Убедитесь, что эмбрионы не продвинулись дальше cellularization этапов. В противном случае, разделение органелл не будет работать (рис. 5С), так как органеллы станет поглощенных в течение тысяч отдельных клеток. У молодых эмбрионов на одну ячейку этапе органеллы могут свободно мигрировать большие расстояния и накапливаться в соответствии с их характерной плотности. Чтобы избежать анализа эмбрионов, которые слишком стары, убедитесь, что (я) включают предварительно коллекции, чтобы женщины заложить старые яйца (шаг 2.4), (II) собирают эмбрионов в течение 3 часов или меньше (шаг 2.5), (III) визуально выбрать эмбрионов до cellularization этапов для встраивания в агар (шаг 4.2), (IV) сохранить вложение время короткой, чтобы предотвратить развитие до конца cellularization (шаг 4.6) и (у) отказаться от эмбрионов, которые не правильно слой (шаг 5.6) . Не экономьте на центрифугирования времени. Хотя некоторые из эмбрионов покажет хороший слоев, даже после всего лишь 10 минут центрифугирования разделение несовместимых с эмбрионом на эмбрион. 30 спинов мин дают весьма устойчивые результаты. Кроме того, больше времени центрифугирования, тем больше слоев стабильным после центрифугирования закончилась. Это важно для тех приложений, в которых требуется время, чтобы процесс дальнейшей эмбрионов перед использованием (например, если они должны быть обработаны для трансплантации или экспериментов установлены для конфокальной анализ). Возможные изменения Яйцо сбора и удаления хориона Многие различные протоколы существуют для шагов 2 и 3 1, 3, 9, и будет работать так же, как те, описанные здесь, сколько эмбрионов используются молодые, яйценоскости высок, и доля неправильно поставил эмбрионов сведена к минимуму. Передне-задней выравнивание протокол ориентирует всех эмбрионов, что задний конец похоронен в агар и передним концом вверх (рис. 3). Это направление хорошо для последовательности, так что можно использовать микропиле в качестве ориентира, какой конец отметил во время центрифугирования (рис. 1, 5). Однако, с практикой, легко выделить ориентацию центрифугировали эмбрионов на различных появление капель липидов и желток слои светлого поля микроскопию. Тогда это становится возможным монтировать эмбрионов либо в конечном итоге, это гибкость, ускоряет процесс монтажа. Неориентированных центрифугирования наиболее трудоемкий и технически сложный аспект протокол монтажа эмбрионы в агар (шаг 4). Она требует, касаясь друг эмбриона дважды (один раз, чтобы вставить ее в отверстие и один раз, чтобы восстановить его после центрифугирования). В качестве альтернативы, можно перенести эмбрионы в шаге 4,1 в микроцентрифужных трубки, наполненные TSS. Когда эти трубы центрифугируют в микроцентрифужных (13000 оборотов в минуту, 10-30 мин), эмбрионы также обычно слой и 10-13. Это изменение позволяет обрабатывать сотни эмбрионов в то же время очень быстро. Тем не менее, отводками, не настолько последовательно, доля эмбрионов не развивается, несмотря на различные слои намного выше центрифугирования сил (~ 16 000 г), чем применяемые в протоколе выше. Более сложным является тот факт, что ориентация эмбрионов является переменной величиной, и можно наблюдать разделение под разными углами к главной оси эмбриона. Эта изменчивость требует экспериментатором, чтобы разобраться после центрифугирования насколько тот или иной эмбрион был устроен в центрифуге трубки. При использовании аутофлюоресценция желтка в качестве маркера для наиболее плотную часть эмбриона, часто это возможно, хотя это требует много практики и многое другое решение сделать это надежно. Если Есть достаточное эмбрионов в образце, можно быть в состоянии разобраться в тех случаях, когда эмбрионы оказались расположены как на рис. 1. Центрифугирование эмбрионов в их яичной скорлупы можно вставлять эмбрионы в агар на шаге 4, не снимая хориона первые 2. При таком подходе, эмбрионы по сбору пластины покрыты галоидоуглеводородов нефти вместо 50% отбеливателя в п. 3.2 (галоидоуглеводородов превращается хорион полупрозрачные). Эмбрионы соответствующих стадиях отобраны и переданы новой пластинкой агар с помощью пинцета, захватывая только нити яйцо с помощью пинцета, повреждениеэмбриона собственно избежать. Эмбрионы вкладывается как в шаге 4,4 через 4,8 с передней нити яйцо торчащий из дыры в агар. Яичную скорлупу удаляется на 50% отбеливателя лечение после эмбрионы были центрифугировали и выкопали из агара, как в пункте 5.4. Центрифугирование в присутствии яичной скорлупы может улучшить скорость devitellinization после фиксации (шаг 6.2), но выбор правильного этапов центрифугирования (шаг 4.2) является более сложной задачей. Применения Эмбрион центрифугирования особенно полезно для колокализации опытов, т. е. для проверки того или иного белка локализуется на некоторых основных органелл. Например, Клар белок присутствует на раннее эмбриональное капли липидов, однако эта локализация является сложной задачей для демонстрации в интактных эмбрионов. Отчасти это происходит потому, что оба Клар puncta и липидные капли в изобилии встречаются эмбриона периферии 10, делая ложные колокализации трудно исключить. Тем не менее, центрифугирования концентратов липидные капли в различных слоя, и, таким образом, колокализации с Клар сигнал становится очевидным 10. Подобный анализ однозначно показал локализации других белков в липидные капли 8, 13-15, в том числе удивительные примеры как и некоторые гистоны 2 и в тех случаях, когда белок присутствует повсеместно, но обогащенный на липидные капли 8. Как эмбрионы могут быть выбраны визуально стадии развития (шаг 4,2), можно даже обнаружить зрения развития регулируется набором белков в липидные капли 8, 15. Тестирование на колокализации с липидные капли особенно легко, так как липидные капли накапливаться в визуально различимых &quot;шапка&quot;, так что никаких дальнейших маркер или пятно, необходимых для идентификации этого слоя. На самом деле, из-за своей легкости и потенциально поразительный визуальный результаты (рис. 1, рис. 5 D, E), наша лаборатория использует эту технику теперь обычно как первое испытание ли кандидат белок локализуется в липидных каплях. В принципе, подобные исследования колокализации должен работать на другие органеллы показано на рис. 1, и, вероятно, для других (в том числе внутриклеточных паразитов), распределение которых в центрифугировали эмбрионов до сих пор не документированы. После центрифугирования концентратов органелл в узкие полосы, это облегчает изоляцию фракции, обогащенной в этих органелл. Этот подход уже был использован для восстановления липидные капли для трансплантации в эмбрионы доноров 2. Он также может быть возможным биохимическом анализе фракции, обогащенной (например, за счет сокращения слои от эмбрионов после фиксации 15). Метод, описанный здесь, имеет приложения вне эмбрионы дрозофилы, как центрифугирование могут быть использованы для стратификации яйца много разных видов (включая лягушек, нематод, оболочников, кольчатых червей, морских ежей, моллюсков и книдарий) 16. В нашей лаборатории мы использовали протокол выше для эмбрионов мухи Musca Domestica 2 и использовали неориентированных центрифугирования в анализ эмбрионов из гриба комара Sciara coprophila 17 и улитки Ilyanassa obsoleta 17. Наконец, этот метод не ограничивается эмбрионов: Центрифугирование также может быть полезна для стратификации других крупных клетках, таких как ооциты (например, в 2-дрозофилы, 18 и молочая ошибка Oncopeltus fasciatus 17). Для разных образцов, точные условия центрифугирования должны быть оптимизированы: Например, 10 минут в 3000 г достаточно эффективно стратифицировать эмбрионов Musca Domestica 2, а если центрифугировали намного дольше, эмбрионы, как правило, разбиваются на части во время фиксации и иммунной окраски.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Основная стратегия для очистки и изоляции различных типов внутриклеточных органелл, чтобы отделить их друг от друга на основе различий в плавучей плотности. Однако, когда клетки разрушаются перед центрифугированием, белки и органеллы в этой неместных среде, зачастую неправильно прилипать друг к другу. Здесь мы опишем метод для разделения по плотности органелл в интактных, живя эмбрионов дрозофилы. Ранние эмбрионы до cellularization собирают от населения клеток, и их внешние оболочки яйца удаляются путем обработки 50% гипохлоритом натрия. Эмбрионы затем перевели в небольшую тарелку агар и вставлены, заднему концу первых, на мелкие вертикальные отверстия в агар. Чашки, содержащие встроенные эмбрионы центрифугировали в течение 30 минут при температуре 3000г. Агар поддерживает эмбрионов и держит их в определенной ориентации. После этого эмбрионы выкопали из агар с тупой иглой. Центрифугирование отделяет основных органелл на отдельные слои, стратификация хорошо видны яркие микроскопии. Число флуоресцентные маркеры доступны для подтверждения успешной стратификации в живых эмбрионов. Белки, связанные с определенными органеллами будет обогащаться в определенном слое, демонстрируя колокализации. Отдельные слои могут быть восстановлены для биохимического анализа или трансплантации донорских яйцеклеток. Эта техника применима для органелл разделения в других крупных клеток, включая яйца и ооцитов различных видов.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Мы опишем метод отдельных органелл по плотности в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионов. Эмбрионы, внедренных в агар и центрифугировали. Эта техника дает воспроизводимые разделение основных органелл вдоль передне-задней оси эмбриона. Этот метод облегчает колокализации экспериментов и дает органелл фракций для биохимического анализа и трансплантации экспериментов.

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Вертикальная съемка Drosophila Эмбрионы

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...