Name: in-vivo centrifugation of drosophila embryos
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

Vi tackar Susan Gerbi, Heidi Smith och David Lambert för att leverera material för att testa in-vivo centrifugeringen på Sciara coprophila och Ilyanassa obsoleta, respektive. Vi tackar medlemmar i Welte labbet för kommentarer på teknik och manus. Utveckling och förfining av in-vivo centrifugeringen analys stöddes av NIGMS bevilja GM64687 till gap. De bilder som visas i bild. 1 och Fig.. 5E har F tidigare publicerat 2 och återges här med tillstånd.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Kritiska steg Se till att agar koncentrationen är tillräckligt hög. Om det är för lågt kommer agar sönder under centrifugeringen, och embryona kommer att brista eller vara slumpmässigt orienterade. Om agar koncentrationen ligger lite för lågt eller om agar är våt (otillräckligt torkad eller otillräcklig borttagning av överskott TSS i steg 4,3), kommer embryon flyta ur sina hålor under centrifugering och blir felaktigt inriktad. Om agar hälls för tunt, kommer det att kollapsa också eller spricka under centrifugering. Se till att embryon inte har avancerat bortom cellularization stadier. Annars kommer separering av organeller fungerar inte (Fig. 5C) sedan organeller blir bundet i tusentals enskilda celler. I yngre embryon i en cell skede organeller är fria att migrera stora avstånd och ansamlas i enlighet med deras karaktäristiska densitet. För att undvika att analysera embryon som är för gamla, se till att (i) inkludera en pre-samling för att honorna att lägga gamla ägg (steg 2,4), (ii) samla in embryon i 3 timmar eller mindre (steg 2,5), (iii) visuellt markera embryon innan cellularization steg för att bädda in agar (steg 4,2), (iv) hålla bädda tiden kort för att förhindra utveckling genom slutet av cellularization (steg 4,6) och (v) kassera embryon som inte lagret på rätt sätt (steg 5,6) . Inte snåla på centrifugeringstiden. Trots att vissa av embryona kommer att visa fin skiktning även efter bara 10 minuter av centrifugering, är separationen inkonsekvent från embryo till embryo. 30 min snurrar ger mycket konsekventa resultat. Dessutom, ju längre centrifugeringstiden, desto längre lagren är stabila efter centrifugering har upphört. Detta är viktigt för de applikationer där det tar tid att bearbeta embryon ytterligare före användning (t.ex. om de behöver behandlas för transplantation experiment eller monteras för konfokala analys). Möjliga ändringar Ägg insamling och chorion borttagning Många olika protokoll för steg 2 och 3 1, 3, 9, och kommer att fungera lika bra som de som beskrivs här så länge som de använda embryon är unga är ägget ger hög och andelen mis- iscensatt embryon minimeras. Anterior-posterior justering Protokollet orienterar alla embryon så att den bakre änden är begravd i agar och den främre änden är upp (bild 3). Denna inriktning är bra för konsekvens, så att det är möjligt att använda micropyle som ett landmärke som slut pekade upp under centrifugering (Fig. 1, 5). Men med praktiken är det lätt att plocka ut riktningen för centrifugerade embryon genom de distinkta utseende lipid-droppe och lager äggula med ljus-fält mikroskop. Då blir det möjligt att montera embryon med antingen hamna; denna flexibilitet snabbar upp monteringen processen. Unoriented centrifugering som mest tidskrävande och tekniskt utmanande aspekt av protokollet är att montera embryon i agar (steg 4). Det kräver att röra varje embryo två gånger (en gång för att sätta in den i hålet och en gång för att återställa det efter centrifugering). Som alternativ kan man överföra embryon vid steg 4,1 till mikrocentrifugrör fyllda med TSS. När dessa rör centrifugeras i mikrocentrifug (13.000 rpm, 10-30 min), embryon kommer också typiskt lager väl 10-13. Denna variation gör att man kan behandla hundratals embryon på samma gång mycket snabbt. Det är dock skiktning inte så konsekvent, en bråkdel av de embryon inte utveckla distinkta skikt trots mycket högre centrifugalkraft (~ 16 tusen g) än som tillämpas i protokollet ovan. Mer utmanande är att inriktningen på embryon varierar, och man kan observera separation i olika vinklar till de stora embryot axeln. Denna variation måste försöksledaren att sortera efter centrifugering hur ett visst embryo arrangerades i centrifugrör. Med hjälp av äggulan autofluorescens som en markör för den mest täta delen av embryot, är detta ofta möjligt, men det kräver mycket övning och mer dom att göra det säkert. Om det finns tillräckligt med embryon i provet, kan man kunna sortera ut de fall där embryon råkade placeras som i figur. 1. Centrifugering av embryon i sina äggskal Det är möjligt att bädda in embryon i agar för steg 4 utan att ta bort chorion första 2. I denna strategi, är embryon om insamling plattan täckt med Halocarbon olja i stället för 50% blekmedel i steg 3.2 (Halocarbon vänder chorion genomskinliga). Embryon av lämpliga steg väljs och överförs till en ny agarplatta med pincett, genom att ta tag bara ägget filament med pincett, skador påembryot rätt undviks. Embryon är inbäddade som i steg 4,4 via 4,8, med den främre ägget trådar sticker upp ur hålet i agar. Den äggskal tas bort med 50% blekmedel behandling efter embryon har centrifugeras och grävde ur agar som i steg 5,4. Centrifugering i närvaro av äggskalet kan förbättra graden av devitellinization efter fixering (steg 6,2), men valet av rätt steg för centrifugering (steg 4,2) är mer utmanande. Applikationer Embryo centrifugering är särskilt användbart för colocalization experiment, dvs att testa om ett visst protein lokaliserar till vissa större organell. Till exempel är den Klar protein som finns på tidig embryonal lipiddropparna, är ännu denna lokalisering utmanande att visa i intakta embryon. Delvis beror detta på att både Klar puncta och droppar lipid är riklig i embryot periferin 10, gör falska colocalization svårt att utesluta. Men koncentrerar centrifugering lipid droppar in i ett separat lager, och därmed blir colocalization med Klar signal uppenbar 10. Liknande analys har entydigt visat att lokaliseringen av andra proteiner att lipiddropparna 8, 13-15, inklusive överraskande exempel som vissa histoner 2 och i de fall då ett protein finns ubiquitously men berikas på lipiddropparna 8. Som embryon kan väljas visuellt genom utvecklingsstadiet (steg 4,2), är det ens möjligt att upptäcka utvecklingsstörda reglerade rekrytering av proteiner till lipiddropparna 8, 15. Test för colocalization med lipiddropparna är särskilt enkelt eftersom lipid droppar samlas i en visuellt distinkt &quot;tak&quot;, så ingen ytterligare markör eller bets krävs för att identifiera detta skikt. I själva verket, på grund av dess lätthet och potentiellt slående visuella resultat (Fig. 1, Fig. 5. D, E), använder vårt laboratorium denna teknik nu rutinmässigt som en första test om en kandidat protein är lokaliserad till lipid droppar. I princip bör liknande colocalization studier arbete för de andra organeller som visas i figur. 1, och sannolikt för andra (inklusive intracellulära parasiter) som distribueras i centrifugeras embryon har ännu inte dokumenteras. Sedan centrifugering koncentrerar organeller i trånga band, det underlättar isolering av en bråkdel anrikas i dessa organeller. Detta tillvägagångssätt har redan använts för att återhämta lipiddropparna för transplantation till donatorn embryon 2. Det kan också vara möjligt att biokemiskt analysera det anrikade fraktionen (t.ex. genom att skära lager av embryon efter fixering 15). Metoden som beskrivs här har tillämpningar utanför Drosophila embryon som centrifugeringen kan användas för att stratifiera ägg från många olika arter (bl.a. grodor, nematoder, manteldjur, annelids, sjöborrar, mollusker, och Cnidarians) 16. I vårt eget laboratorium har vi använt protokollet ovan för embryon av husfluga Musca domestica 2 och har anställt unoriented centrifugering i analysen av embryon från svampen gnat Sciara coprophila 17 och snigeln Ilyanassa obsoleta 17. Slutligen är denna metod inte begränsat till embryon: Centrifugering kan också vara bra att stratifiera andra stora celler, såsom oocyter (t.ex. i Drosophila 2, 18 och milkweed bugg Oncopeltus fasciatus 17). För olika exemplar, den exakta centrifugering villkor måste optimeras: Till exempel är 10 minuter vid 3000 g är tillräcklig för att effektivt stratifiera embryon Musca domestica 2, och om centrifugeras mycket längre, embryona tenderar att bryta isär under fixering och immunfärgning.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

En viktig strategi för rening och isolering av olika typer av intracellulära organeller är att skilja dem från varandra som bygger på skillnader i stigande densitet. Men när celler störs före centrifugering, proteiner och organeller i denna främmande miljö ofta olämpligt hålla sig till varandra. Här beskriver vi en metod att separera organeller av täthet i intakta, levande Drosophila embryon. Tidiga embryon innan cellularization skördas från befolkningen burar, och deras yttre äggskal avlägsnas genom behandling med 50% blekmedel. Embryon överförs sedan till en liten agarplatta och införas bakändan först i små vertikala hål i agar. Plattorna innehåller inbäddade embryon centrifugeras i 30 min vid 3000g. Den agar stöder embryon och håller dem i en definierad inriktning. Efteråt är de embryon grävt ur agar med en trubbig nål. Centrifugering separerar stora organeller i olika lager, en skiktning väl synlig med ljus-fält mikroskop. Ett antal fluorescerande markörer finns för att bekräfta lyckad skiktning i levande embryon. Proteiner är förknippade med vissa organeller kommer att berikas på ett visst lager, vilket visar colocalization. Individuella lager kan återvinnas för biokemisk analys eller transplantation till givare ägg. Denna teknik är tillämpligt för organell separation i andra stora celler, inklusive ägg och ägg av olika arter.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Vi beskriver en metod att separera organeller av täthet i levande<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon. Embryon är inbäddade i agar och centrifugeras. Denna teknik ger reproducerbar separation av stora organeller längs den främre-bakre embryo axeln. Denna metod underlättar colocalization experiment och avkastningen organell fraktioner för biokemisk analys och experiment transplantation.

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Beredningen av Drosophila Embryon för Live-Imaging Använda droppe protokollet

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upprätt Imaging av Drosophila Embryon

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging av intakt Drosophila Larver på sub-cellulära upplösning

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Störningar av dsRNA Injektion i Drosophila Embryon

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...