Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

세포가 포함된 전자 현미경 그리드를 급강하 동결하기 전에 도립 광학 현미경으로 그리드를 검사합니다. 각 그리드의 셀 밀도를 기록하여 플런지 동결 중 블로팅 시간을 조정합니다. 섭씨 37도의 빈 접시에 2-3밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 데우십시오.

금 기준점 준비를 위해 50마이크로리터의 10나노미터 콜로이드 금 비드 용액을 깨끗한 1.5밀리리터 튜브에 피펫팅합니다. 2 마이크로 리터의 소 혈청 알부민을 첨가하고 마이크로 피펫팅으로 반복적으로 균질화합니다. 15, 000에서 20, 15 분 동안 000 G에 관을 분리하십시오.

마이크로 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 50마이크로리터의 PBS에 다시 부유시키고 튜브를 다시 원심분리합니다., 이전에 시연된 것처럼. 10 마이크로 리터 팁을 사용하여 4 마이크로 리터의 펠릿을 흡입하고 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

95%humidity와 30 섭씨 온도에 환경 약실을 설치하십시오. 5 x 15 핀셋을 사용하여 그리드를 선택하고 PBS로 세척하십시오. 세척된 그리드를 플런징 핀셋으로 옮깁니다.

그리드가 고정되면 5 x 15 핀셋을 제거하고 플런지 핀셋에 클램프를 밉니다. cl을 유지하면서 그리드를 플런지 냉동고에 삽입하십시오.amp 안전하게. 그리드의 뒷면에 1마이크로리터의 금 기준점을 추가합니다.

그런 다음 그리드의 탄소 쪽에 2-3 마이크로 리터의 PBS를 추가합니다. 액체 에탄에 동결되기 전에 자동 블로팅을 사용하여 그리드의 뒷면을 오그라지게 합니다. 형질주입된 U2OS 세포의 초저온 상관 광 및 전자 현미경 이미지는 HIV 생성 세포의 존재를 보여주었습니다.

전자 초저온 단층 촬영 이미지는 U2OS 세포의 원형질막에서 여러 HIV 입자가 싹트는 것을 보여주었습니다.