まず、組み立てたマイクロSIMデバイスを滅菌ホースクランプに入れます。大きな滅菌ペトリ皿でデバイスを培養します。湿度を高めるには、滅菌水で満たされた50ミリリットルの円錐形のチューブ蓋を置きます。
細胞培養用のデバイスを準備するには、上部チャンバーを100マイクロリットルの水ですすいでください。次に、コラーゲン4種、ウシフィブロネクチン及び滅菌水を混合して塗布液を調製する。トップチャンバーから水を取り除き、100マイクロリットルのコーティング液を追加します。
チャンバーを摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、トップチャンバー内のコーティング液を100マイクロリットルの室温HECSRと交換します。底部チャンバーに20マイクロリットルのHECSR溶液を追加します。
EECM-BMEC様細胞を継代するには、細胞に細胞剥離酵素混合物を加え、摂氏37度で5〜8分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液をピペットで移し、遠心チューブ内の内皮培地の4倍の容量に加えます。200Gで5分間遠心分離し、細胞を1ミリリットルのHECSRに再懸濁します。
上部チャンバーに1平方センチメートルあたり40、000細胞の密度で細胞を播種し、細胞接着を促進するために摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、両方のチャンバーで培地を新鮮なHECSRと交換します。マイナス20°Cで冷やした100%メタノール20マイクロリットルを下部チャンバーに、50マイクロリットルを上部チャンバーに20マイクロリットル加えてセルを固定します。
デバイスを室温で2〜10分間インキュベートします。次に、20マイクロリットルのPBSを下部チャンバーに、100マイクロリットルを上部チャンバーに追加して細胞を洗浄します。各洗浄後、底部チャンバーに気泡がないことを確認します。
20マイクロリットルのブロッキング溶液を下部チャンバーに、50マイクロリットルを上部チャンバーに加えて、細胞を30分間ブロックします。ブロッキング後、トップチャンバー内の容量を50マイクロリットルの一次抗体溶液と交換し、室温で1時間インキュベートします。PBS洗浄後、50マイクロリットルの二次抗体溶液をトップチャンバーに加え、光から保護して1時間インキュベートします。
PBS洗浄後、50マイクロリットルのヘキストをトップチャンバーに加え、3分間インキュベートします。次に、20マイクロリットルのPBSを下部チャンバーに、100マイクロリットルを上部チャンバーに追加します。共焦点顕微鏡ですぐにデバイスを画像化します。
湿式長作動距離の40倍対物レンズを使用してメンブレンウィンドウの位置を特定し、蛍光チャンネルに切り替えてヘキスト染色と接合部染色を確認します。ここでは、HIPSC細胞培養およびアンダーシードBPLCの最適なシート密度を示します。HIPSC由来の共培養は、初代共培養よりも位相差イメージングで区別しやすかった。
BPLCの播種が少ないと、寄生虫の被覆率が悪くなり、食べ過ぎで凝集すると、寄生虫層が膜から剥がれ落ちます。免疫染色されたHIPSC由来の細胞共培養では、薄い窒化ケイ素ナノメンブレンによってのみ隔てられた2層の細胞が近接して見られました。透過性アッセイにおいて、2日間培養した内皮細胞の透過性のばらつきが大きいことは、2日間の培養がバリア成熟に不十分であったことを示している。
さらに、4日後のバリア成熟時のラボ間の透過性に有意差はありませんでした。
