Pour commencer, préparez les quatre feuilles de papier filtre, mesurant chacune 12,5 x 7,5 centimètres. Empilez deux feuilles ensemble et placez la pile dans le tampon de transfert pour qu’elle s’imprègne. Placez la membrane PVDF dans de l’éthanol à 95% et agitez la membrane sur une bascule pendant une minute.
Souvenez-vous de l’éthanol. Immergez la membrane dans le tampon de transfert. Et agitez pendant deux minutes.
Ensuite, posez la pile de papier filtre de trempage sur une surface plane et mobile, comme un grand couvercle, et aplatissez-la à l’aide d’un rouleau. À l’aide d’un dégel ou d’une pince à épiler, positionnez soigneusement la membrane PVDF sur la pile. Ensuite, placez une seule feuille de papier filtre sec sur cette membrane et faites glisser le rouleau sur le papier pour absorber tout excès de tampon qui se trouve à la surface de la membrane.
Soulevez le papier filtre supérieur sans frotter contre la membrane. Prélevez des échantillons de fibres isolées du congélateur et décongelez-les à température ambiante avant de centrifuger et de remettre l’échantillon en suspension. Placez une gouttelette d’un microlitre de chaque échantillon au centre de la zone membranaire désignée.
Évitez de toucher la membrane avec l’embout de la pipette. Laissez les gouttelettes de l’échantillon être entièrement absorbées par la membrane pendant 15 minutes. Ensuite, à l’aide d’un dégel ou d’une pince à épiler, soulevez délicatement la membrane de la pile de papier filtre humide.
Placez-le sur une feuille de papier filtre sèche et laissez-le pendant au moins cinq minutes pour le déshydrater. Réactivez la membrane une fois que les taches d’échantillon sont devenues complètement blanches. Procédez ensuite à l’immunomarquage de la protéine cible.
Apprenez à utiliser l’intensité du panneau de signaux pour classer l’intensité des isoformes du CMH et des signaux d’actine à partir des images de transfert de points. La détection des protéines cibles fortes, moyennes et faibles est indiquée par des signaux saturés, modérés et faibles respectivement. Pour l’identification du type de fibre, comparez d’abord les résultats de la chaîne lourde de la myosine IIA et de la chaîne lourde de la myosine.
Documentez les fibres qui n’affichent qu’une seule isoforme de chaîne lourde de myosine avec une intensité de signal saturée ou modérée. Enregistrez les fibres détectées avec l’actine et aucune détection de la myosine à chaîne lourde 1 ou IIA comme type potentiel 2X. Si un faible signal d’isoforme de chaîne lourde de myosine est présent avec un signal d’actine désaturé modéré, enregistrez-le comme non identifié.
Éliminez les échantillons contenant des protéines cibles faibles ou non détectées. Les fibres présentant des signaux saturés ou modérés de MHCIIA et de MHC1 ne doivent pas être utilisées pour la préparation spécifique au type de fibre. Après l’identification MYO1D, préparez des échantillons de type un et deux en combinant des fibres avec des signaux saturés ou modérés pour l’isoforme MHC respective.
Utilisez 10 microlitres de chaque échantillon spécifique au type de fibre et séparez-les sur une page de gel préfabriqué par FDS, en suivant les directives du fabricant. Utiliser un imageur sur gel pour détecter l’isoforme cible du CMH, en suivant le protocole du fabricant. Comparez l’intensité du signal de chaque isoforme de CMH dans tous les échantillons spécifiques au type de fibre.
L’ID du type de fibre est confirmé par l’isoforme correcte du CMH à une intensité de signal modérée ou saturée. L’immunomarquage de la tache de points a permis d’identifier les fibres de type 2, les fibres de type 1 et les fibres potentielles de type 2X. Les échantillons spécifiques au type de fibre ont été validés à l’aide d’anticorps spécifiques à la chaîne lourde du transfert Western et de la myosine.