Name: Confocal Live Cell Imaging of Rat Skeletal Muscle Mitochondria (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00
Duration: 3 min 4 s
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confocal live cell imaging of rat skeletal muscle mitochondria

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

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Confocal Live Cell Imaging of Rat Skeletal Muscle Mitochondria (Video) | JoVE 

Imaging confocale di cellule vive dei mitocondri del muscolo scheletrico di ratto

Inizia incubando le fibre muscolari scheletriche di ratto con TMRE a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, avvia il software standard del microscopio confocale e scegli il framework di configurazione. Nella finestra di dialogo Configurazione hardware, selezionare Laser e selezionare l'opzione Helium Neon 543.Accedete alla finestra di dialogo di acquisizione tramite il framework Acquisisci e selezionate il pannello XYZ. Quindi, selezionare il formato 512x512 con una velocità di 400 hertz. Sotto il pannello stenopeico visualizzato, selezionare unità arbitrarie e immettere tre aree per il foro stenopeico.Nella finestra di dialogo Impostazioni Bean Path, selezionare un obiettivo a immersione in acqua 20 x con un'apertura numerica di 0,7 e una finestra di lunghezza d'onda di emissione compresa tra 576 e 700 nanometri. Scegliere DD 488543 e impostare la potenza del laser 543 al 15%Dopo un'incubazione di 20 minuti, cambiare due volte il mezzo di incubazione. Successivamente, preparare la camera di registrazione con un vetrino coprioggetto in silicato boro da 0,15 millimetri.Trasferire i fasci di fibre nella camera contenente 200 microlitri di soluzione rilassata. Utilizza la modalità di campo chiaro del microscopio confocale per identificare le fibre vitali per la registrazione fluorescente dei mitocondri. Regolazione, guadagno e offset scansionando la fluorescenza utilizzando il pulsante Live.Scegliere bassi valori di intensità fluorescente per uno sfondo di unità arbitrarie quasi nulle e un segnale mitocondriale compreso tra 100 e 200 unità arbitrarie. Selezionare una dimensione dei pixel compresa tra 150 e 190 nanometri e regolare il fattore di zoom nella finestra di dialogo XY per acquisire l'intera larghezza della fibra. Nella finestra di dialogo Stack Z, impostare la distanza Z a partire da una profondità della fibra di 15 micrometri fino a 22 micrometri e scegliere una dimensione del passo Z di 3 micrometri.Fare clic sul pulsante Start per acquisire le immagini confocali e ottenere una pila Z composta da tre immagini confocali acquisite a 15, 18 e 21 micrometri di profondità. Le immagini confocali di una fibra muscolare magra esercitata mostrano una registrazione prevista di mitocondri della fibra muscolare scheletrica con un modello di fibre coerente. Al contrario, la fibra muscolare del ratto obeso mostra alterazioni sostanziali nel contenuto e nella distribuzione mitocondriale.

Research

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Biology

Confocal Live Cell Imaging of Rat Skeletal Muscle Mitochondria

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