Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Wir sind hoch verschuldet, um Jonathon Howard, dessen Gruppe entwickelte das grundlegende Protokoll für eine gleitende Beweglichkeit Assay, der anschließend von uns angepasst wurde. Finanzielle Unterstützung von NSF gewähren DMR0645023 gedankt.

1). Puffer und Reagenzien Diese Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden und in handliche Portionen. Ein Aliquot sollte genügend Lösung für ein typisches Experiment und ein frisches Aliquot sollte für jede Motilität Assay verwendet werden. Die Lagerbedingungen und die typischen aliquoten Größen sind auch in den folgenden Protokollen erwähnt. 1. BRB80 Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionisiertem destilliert (dd) Wasser, pH-Wert ...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Mit geringfügigen Änderungen wurde das Protokoll erfolgreich von einer Vielzahl von Gruppen verwendet werden, um Kinesin-Mikrotubuli-basierte Motilität Assays zu montieren. 10 mM DTT in den letzten Motilität Lösung kann mit 0,5% β-Mercaptoethanol ersetzt werden. Standard-Lösungen (BRB80AF, KIN20 und MT1000) mehr als 2 Stunden alt sollte nicht verwendet werden. Jede Lösung enthält Taxol und insbesondere Mikrotubuli sollte niemals auf Eis gelegt werden. Übermäßige Exposition der Messzelle gegen UV-Anregungslic...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Zellen verfügen über ausgefeilte molekulare Maschinerie entwickelt, wie Kinesin Motorproteine ​​und Mikrotubuli, zu aktiven intrazellulären Transport von Gütern zu unterstützen. Während Kinesine Schwanz Domäne bindet an eine Vielzahl von Ladungen, nutzen Kinesine Kopfdomänen die chemische Energie in ATP-Molekülen gespeichert, um entlang der Mikrotubuli Gitter Schritt. Die langen, steifen Mikrotubuli dienen als Schienen für den Fernverkehr intrazellulären Transport. Diese Motoren und Filamente können auch in mikrofabrizierten synthetischer Umgebungen als Komponenten der molekularen Shuttles 1 eingesetzt werden. In einer häufig verwendeten Design sind Kinesin-Motoren auf die Fahrbahn durch ihre Schwänze verankert, und funktionalisierte Mikrotubuli dienen als Fracht tragenden Elemente, die von diesen Motoren angetrieben werden. Diese Shuttles können mit Ladung durch die Nutzung der starke und selektive Bindung zwischen Biotin und Streptavidin geladen werden. Die wichtigsten Komponenten (biotinylierten Tubulin, Streptavidin und biotinylierten Ladung) sind kommerziell erhältlich. Aufbauend auf den klassischen invertierten Motilität Test 2 ist der Aufbau von molekularen Shuttles detaillierte hier. Kinesin Motorproteine ​​sind an einer Oberfläche mit Kasein vorbeschichtet adsorbiert; Mikrotubuli sind aus biotinylierten Tubulin polymerisiert, haftete an der Kinesin und anschließend mit Rhodamin-markiertem Streptavidin beschichtet. Die ATP-Konzentration ist bei subsaturating Konzentration aufrechterhalten, um ein Mikrotubulus Gleiten Geschwindigkeit optimal für Beladen 3 zu erreichen. Schließlich biotinylierten fluoresceinmarkierten Nanokügelchen als Fracht aufgenommen. Nanospheres an Mikrotubuli legen als Resultat von Kollisionen zwischen Gleiten Mikrotubuli und Nanokügelchen an der Oberfläche haften. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um eine Vielzahl von Ladungen wie biotinylierten DNA 4, Quantenpunkte 5 oder eine Vielzahl von Antigenen über biotinylierte Antikörper 4-6 laden.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Ex vivo mechanische Belastung der Sehnen

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Forschung

Biologie

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...