Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
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हम भारी Jonathon हावर्ड, जिसका समूह एक ग्लाइडिंग गतिशीलता परख जो बाद में हमारे द्वारा रूपांतरित किया गया के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए ऋणी हैं. NSF अनुदान DMR0645023 से वित्तीय सहायता आभार स्वीकार किया है.

1.) Buffers और अभिकर्मकों ये समाधान अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए और सुविधा आकार aliquots में संग्रहीत. एक विभाज्य एक विशिष्ट प्रयोग है और एक ताजा विभाज्य प्रत्येक गतिशीलता परख के लिए इस्तेमाल किया ज...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक किया गया है समूहों की एक किस्म के द्वारा इस्तेमाल किया kinesin microtubule आधारित गतिशीलता assays इकट्ठा. अंतिम गतिशीलता समाधान में 10 मिमी डीटीटी 0.5% β-mercaptoethanol के साथ प्?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

कक्ष परिष्कृत आणविक मशीनरी विकसित किया है, जैसे kinesin मोटर प्रोटीन और microtubule filaments के लिए माल की सक्रिय intracellular परिवहन का समर्थन. जबकि kinesins पूंछ डोमेन कार्गो की एक किस्म के लिए बांधता है, kinesins सिर डोमेन रासायनिक एटीपी अणुओं में संग्रहीत करने के लिए microtubule जाली साथ कदम ऊर्जा का उपयोग. लंबे, कठोर सूक्ष्मनलिकाएं लंबी दूरी intracellular परिवहन के लिए पटरियों के रूप में में सेवा करते हैं. ये मोटर्स और filaments microfabricated कृत्रिम वातावरण में भी आणविक एक शटल के घटक के रूप में नियोजित किया जा सकता है . एक बार इस्तेमाल किया डिजाइन में, kinesin मोटर्स उनके पूंछ के माध्यम से ट्रैक की सतह के लिए anchored रहे हैं, और functionalized सूक्ष्मनलिकाएं माल ले जाने के तत्वों, जो इन मोटर्स द्वारा चालित हैं के रूप में सेवा करते हैं. इन शटल बायोटिन और streptavidin के बीच मजबूत और चयनात्मक बंधन का उपयोग करके माल के साथ लोड किया जा सकता है. प्रमुख घटक (biotinylated ट्यूबिलिन, streptavidin और biotinylated कार्गो) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. क्लासिक उल्टे गतिशीलता परख 2 पर बिल्डिंग, आणविक शटल के निर्माण यहाँ विस्तृत है. Kinesin मोटर प्रोटीन कैसिइन के साथ Precoated सतह adsorbed, सूक्ष्मनलिकाएं biotinylated ट्यूबिलिन से polymerized हैं, kinesin के लिए पालन और बाद में rhodamine लेबल streptavidin के साथ लेपित हैं. 3 माल लदान के लिए एक microtubule ग्लाइडिंग इष्टतम वेग प्राप्त करने के एटीपी एकाग्रता subsaturating एकाग्रता पर बनाए रखा है. अंत में biotinylated, fluorescein लेबल nanospheres माल के रूप में जोड़ रहे हैं. Nanospheres ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं और nanospheres सतह का पालन करने के बीच collisions का एक परिणाम के के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं को देते हैं. प्रोटोकॉल करने के लिए आसानी से किया जा biotinylated डीएनए 4, क्वांटम 5 डॉट्स या biotinylated 4-6 एंटीबॉडी के माध्यम से प्रतिजनों की एक विस्तृत विविधता जैसे कार्गो की एक किस्म को लोड करने के लिए संशोधित कर सकते हैं.

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Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

आण्विक शटल functionalized सतह पालन kinesin मोटर प्रोटीन nanoscale एक परिवहन प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं पर ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं से मिलकर. यहाँ एक ठेठ शटल प्रणाली की विधानसभा में वर्णित है.

Kinesin संचालित आण्विक शटल पर कार्गो लोड हो रहा है

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

कण्डरा के पूर्व vivo यांत्रिक लोड हो रहा है है

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

कैल्शियम संकेतक के साथ लोड हो रहा है ड्रोसोफिला तंत्रिका टर्मिनल

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Tre Recombinase के आण्विक विकास

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Matrigel पर MEFs से बंटवारे hESCs: MEFs Matrigel 2 से

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

MEFs से Matrigel 3: Matrigel पर passaging Matrigel से hESCs

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

विधानसभा, लोड हो रहा है, और एक विश्लेषणात्मक ultracentrifuge नमूना सेल के संरेखण

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

अलगाव और kinesin के शोधन से ड्रोसोफिला भ्रूण

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

लक्षित-esterase साथ ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष इमेजिंग प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

एक &quot;Humanized&quot; सृजन<em&gt; ड्रोसोफिला</emKinesin -5 के औषधीय निषेध करने के लिए&gt; S2 सेल लाइन संवेदनशील

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Kinesin-1 cargos के पहचान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...