Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
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Siamo fortemente indebitati a Jonathon Howard, il cui gruppo ha sviluppato il protocollo di base per un test di volo a vela motilità che è stato successivamente adattato da noi. Il sostegno finanziario NSF concedere DMR0645023 Si ringrazia.

1.) Tamponi e reagenti Queste soluzioni dovrebbero essere preparate in anticipo e conservato in aliquote comodamente dimensioni. Una aliquota dovrebbe contenere soluzione sufficiente per un tipico esperimento e una nuova aliquota dovrebbe essere utilizzato per ogni dosaggio motilità. Le condizioni di conservazione e le dimensioni aliquota tipici sono menzionati anche i seguenti protocolli. 1. BRB80 tampone, (80 TUBI mM, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionizzat...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Con piccole modifiche, questo protocollo è stato usato con successo da una varietà di gruppi di assemblare chinesina-microtubuli saggi motilità base. DTT 10 mM nella soluzione motilità finale può essere sostituito con lo 0,5% β-mercaptoetanolo. Soluzioni standard (BRB80AF, KIN20 e MT1000) più di 2 ore di vita non deve utilizzare. Qualsiasi soluzione contenente microtubuli taxolo e soprattutto non devono mai essere posti su ghiaccio. L&#39;eccessiva esposizione della cella di flusso ai risultati UV luce di eccitaz...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Le cellule hanno sviluppato sofisticate macchine molecolari, come chinesina proteine ​​motrici e filamenti di microtubuli, al sostegno attivo di trasporto intracellulare di carico. Mentre kinesins coda dominio si lega ad una varietà di carichi, domini testa kinesins utilizzare l&#39;energia chimica immagazzinata nelle molecole di ATP per passo lungo il reticolo microtubuli. Il lungo e rigido microtubuli fungono da piste per lunghe distanze di trasporto intracellulare. Questi motori e filamenti possono anche essere impiegati in microfabbricazione ambienti sintetici come componenti di navette molecolari 1. In un progetto di uso frequente, i motori chinesina sono ancorati alla superficie della pista con la coda, e microtubuli funzionalizzate servire come elementi costitutivi di trasporto merci, che sono spinti da questi motori. Queste navette possono essere caricati con il carico utilizzando il legame forte e selettiva tra biotina e streptavidina. I componenti chiave (tubulina biotinilato, streptavidina, e carico biotinilato) sono disponibili in commercio. Sulla base del classico saggio motilità invertita 2, la costruzione di navette molecolari è dettagliata qui. Chinesina proteine ​​motrici sono assorbiti da una superficie coperte con caseina; microtubuli sono polimerizzati da tubulina biotinilato, ha aderito al chinesina e successivamente rivestito con streptavidina marcata con rodamina. La concentrazione di ATP è mantenuto a concentrazione subsaturating di raggiungere una velocità ottimale microtubulo scorrimento per il carico merci 3. Infine, biotinilato marcato con fluoresceina nanosfere vengono aggiunti come merce. Nanosfere allegare ai microtubuli a causa di collisioni tra microtubuli volo a vela e nanosfere aderire alla superficie. Il protocollo può essere facilmente modificato per caricare una varietà di carichi come il DNA biotinilato 4, 5 o quantum dots una vasta gamma di antigeni tramite anticorpi biotinilati 4-6.

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Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Navette molecolari costituiti da microtubuli funzionalizzati scivolando sulla superficie aderito chinesina proteine ​​motore può servire come sistema di trasporto su scala nanometrica. Qui, l&#39;assemblaggio di un sistema di navetta tipico è descritto.

Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

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