Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
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우리는 그의 그룹 이후 회사에 의해 조정되었다 글라이딩 운동성 분석을위한 기본 프로토콜을 개발 조나단 하워드에 크게 빚을 수 있습니다. NSF 그랜트 DMR0645023의 재정 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.

1.) 버퍼 및 시약 이러한 솔루션은 사전에 준비하고 편리하게 크기 aliquots에 보관해야합니다. 나누어지는는 전형적인 실험과 신선한 나누어지는 각 운동성 분석을 위해 사용되어야에 대한 충분한 해결책을 포함해야합니다. 저장 조건 및 전형 나누어지는 크기는 다음과 같은 프로토콜에 언급하고 있습니다. 1. BRB80 버퍼 (80 MM 파이프, 1 MM MgCl 2, deionized...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

사소한 수정이 프로토콜은 성공적으로 kinesin - 미세 소관 운동성 기반의 assays를 조립하는 그룹의 다양한 의해 사용되고 있습니다. 최종 운동성 솔루션 10 MM의 DTT는 0.5 % β - 메르 캅 토 에탄올로 대체 수 있습니다. 2 시간 이상 된 표준 솔루션 (BRB80AF, KIN20 및 MT1000) 사용해서는 안됩니다. 특히 taxol과 microtubules를 포함한 모든 솔루션은 얼음에 배치해서는 안됩니다. 기능 구성 요소 photodamage의 UV 여기 ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

세포는화물의 적극적인 세포내 수송을 지원하기 위해, 이러한 kinesin 모터 단백질 및 미세 소관의 필라멘트로 복잡한 분자 기계를 발전시켜 왔습니다. kinesins 꼬리 도메인화물의 다양한 바인딩 있지만, kinesins 머리 도메인은 미세 소관을 따라 격자 단계로 ATP 분자에 저장된 화학 에너지를 활용. 길고 뻣뻣한 microtubules는 장거리 세포내 전송을위한 트랙으로 제공하고 있습니다. 이러한 모터 및 필라멘트는 분자 셔틀 하나의 구성 요소로서 microfabricated 합성 환경에서 근무하실 수 있습니다. 자주 사용되는 디자인, kinesin 모터 자신의 꼬리를 통해 트랙 표면에 고정하고, 기능화 microtubules이 모터에 의해 추진 아르화물 운송 요소로 제공하고 있습니다. 이 셔틀은 비오틴과 streptavidin 사이의 강력하고 선택 바인딩을 이용하여화물로 로드할 수 있습니다. 주요 구성 요소 (biotinylated tubulin, streptavidin과 biotinylated화물) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 고전 거꾸로 운동성 분석 2 빌딩 분자 셔틀 건설 여기서 자세한 내용입니다. Kinesin 모터 단백질은 카제인과 precoated 표면에 adsorbed되며 microtubules는 biotinylated tubulin에서 polymerized kinesin을 준수하고 이후 rhodamine - 라벨 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. ATP 농도는화물 3 로딩을위한 최적의 미세 소관 글라이딩 속도를 달성하는 subsaturating 농도에서 관리하고 있습니다. 마지막으로, 플루오레신 - 표시 nanospheres은화물로 추가됩니다 biotinylated. Nanospheres은 표면에 준수 글라이딩 microtubules와 nanospheres 사이의 충돌의 결과로 microtubules을 첨부합니다. 프로토콜은 쉽게 이러한 biotinylated DNA 4, 양자 점 5 biotinylated 항체 4-6 통해 항원의 다양한으로화물의 다양한 로드할 수 수정할 수 있습니다.

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Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

텐든의 전 생체내 기계 중

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

연구

생물학

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

트레 Recombinase의 분자 진화

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

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대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

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&quot;인간 답게&quot;를 생성<em&gt; 초파리</em키네신-5의 약리 억제에&gt; S2 세포주 민감성

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...