Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Мы с крупной задолженностью, чтобы Джонатан Говард, чья группа разработала основной протокол для анализа скольжения моторики который впоследствии был адаптирован нами. Финансовая поддержка со стороны NSF гранта DMR0645023 это с благодарностью.

1.) Буферы и реагенты Эти решения должны быть подготовлены заранее и хранить в удобной размера порции. Аликвоту должна содержать достаточное решение для типичного эксперимента и свежей аликвоты должна использоваться для каждого моторики анализа. Условий хранения и типи?...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

С незначительными изменениями этот протокол был успешно используется различными группами, чтобы собрать кинезин-микротрубочек основан анализов подвижности. 10 мМ DTT в окончательном решении моторики может быть заменен на 0,5% β-меркаптоэтанола. Стандартные решения (BRB80AF, KIN20 и MT1000) больше,...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Клетки развивались сложные молекулярные машины, такие как кинезин моторных белков микротрубочек и нитей, для поддержки активного внутриклеточного транспорта грузов. Хотя кинезины хвост домен связывается с различными грузами, домены кинезины голову использовать химическую энергию, запасенную в молекулах АТФ, чтобы шаг по микротрубочек решетки. Длинные, жесткие микротрубочки служат треков для дальних внутриклеточного транспорта. Эти двигатели и нити могут быть также использованы в microfabricated синтетических средах в качестве компонентов молекулярных челноков 1. В часто используемых дизайн, кинезин двигатели крепятся к поверхности трассы через их хвосты, и функциональных микротрубочки служат в качестве груза несущих элементов, которые в движение с помощью этих двигателей. Эти челноки могут быть загружены с грузом, используя сильное и избирательное связывание между биотином и стрептавидином. Ключевых компонентов (биотинилированного тубулина, стрептавидина и биотинилированного груза) имеются в продаже. Опираясь на классическое перевернутой анализа подвижности 2, строительство молекулярные челноки подробно здесь. Кинезин моторных белков адсорбируются на поверхности предварительно нанесенным покрытием с казеина; микротрубочки полимеризуются с биотинилированного тубулина, придерживались кинезин, а затем покрыты родамин-меченого стрептавидином. Концентрации АТФ поддерживается на subsaturating концентрации, чтобы достичь скорости скольжения микротрубочек оптимальным для погрузки груза 3. Наконец, биотинилированного флуоресцеина меченых наносферы добавляются в качестве груза. Наносфер, придают микротрубочек в результате столкновений между микротрубочек скольжение и наносфер присоединения к поверхности. Протокол может быть легко изменены, чтобы загружать как различные грузы, такие как ДНК биотинилированного 4, квантовые точки, 5 или разнообразных антигенов с помощью антител биотинилированного 4-6.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Молекулярные челноки, состоящий из микротрубочек функционализированных скользит по поверхности, придерживался кинезин моторных белков могут служить в качестве наноразмерных транспортной системы. Здесь, сборка типичной системе трансфер описывается.

Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Экс естественных механические нагрузки сухожилия

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

С MEFs к Матригель 2: Разделение ЭСК из MEFs на Матригель

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

С MEFs к Матригель 3: пассажи из ЭСК Матригель на Матригель

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Создание &quot;гуманизированные&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 клеточной линии Чувствительные к фармакологическим ингибирование Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Идентификация Kinesin-1 Грузы с помощью флуоресцентной микроскопии

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...