Name: cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Biz yoğun olan grup, daha sonra bize adapte oldu bir kayma motilite tayini için temel protokolü geliştirildi Jonathon Howard, borçlu. NSF hibe DMR0645023 mali destek minnetle kabul edilmektedir.

1) Tamponlar ve Reaktifler Bu çözümler, önceden hazırlanmış ve uygun büyüklükteki alikotları saklanmalıdır. Bir kısım tipik bir deney ve taze bir kısım her motilite tayini için kullanılması gereken yeterli bir çözüm bulunmalıdır. Saklama koşulları ve tipik kısım boyutları da aşağıdaki protokollerden söz edilmektedir. 1. BRB80 tampon, (80 mM BORU, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA deiyonize distile (dd) su, KOH ile 6.9 pH değeri ayarl...

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Küçük değişiklikler ile bu protokolü kinesin-mikrotübül tabanlı motilite testleri başarıyla monte etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılan olmuştur. Son motilite çözüm 10 mM DTT,% 0.5 &#39;β-mercaptoethanol ile değiştirilebilir. 2 saatten fazla standart çözümler (BRB80AF KIN20 ve MT1000) olmamalıdır. Taksol ve özellikle mikrotübül içeren herhangi bir çözüm, buz üzerinde atÛlmamalÛdÛr. Işlevsel bileşenleri fotohasar UV uyarma ışık akışını hücrenin aşırı maruz ka...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Hücreler kinesin motor proteinlerin ve mikrotübül filamentler gibi aktif hücre içi kargo taşımacılığı desteklemek için, gelişmiş moleküler makineler gelişmiştir. Kinesins kuyruk etki alanı yüklerin çeşitli bağlar iken, kinesins baş etki alanı mikrotübül kafes boyunca adım ATP molekülleri depolanan kimyasal enerjiyi kullanır. Uzun, sert mikrotübül, uzun mesafe hücre içi ulaşım için parça olarak hizmet vermektedir. Bu motorlar ve filamentler, aynı zamanda moleküler mekik 1 bileşenleri olarak microfabricated sentetik ortamlarda istihdam edilebilir. Sık kullanılan bir tasarım, kinesin motorlar kendi kuyrukları ile parça yüzey demirlemiş ve Fonksiyonlu mikrotübüllerin bu motorlar ile hareketli yük taşıyan unsurları, olarak hizmet vermektedir. Bu mekik, biotin ve streptavidin arasında güçlü ve seçici bir bağlayıcılığı kullanan kargo ile yüklenebilir. Anahtar bileşenleri (biotinlenmiş tubulin, streptavidin ve biotinlenmiş kargo) ticari olarak kullanılabilir. Klasik ters motilite tayini 2 Bina, inşaat moleküler mekiklerinin burada ayrıntılı. Kinesin Motor proteinleri kazein ile kaplanmış bir yüzeye adsorbe; mikrotübül, biotinlenmiş tubulin polimerize kinesin yapıştırılır ve daha sonra rodamin etiketli streptavidin ile kaplı. ATP konsantrasyonu kargo 3 yükleme için optimum bir mikrotübül kayma hızı elde etmek için subsaturating konsantrasyon tutulur. Son olarak, biotinlenmiş floresein etiketli nanokürecikler kargo olarak eklenir. Nanokürecikler kayma yüzeyine yapışan mikrotübül ve nanokürecikler arasındaki çarpışmalar sonucu olarak mikrotübül eklemek. Protokol biotinlenmiş DNA 4, kuantum noktaları 5 veya biotinlenmiş antikorlar 4-6 aracılığıyla antijenleri geniş bir yelpazede çeşitli yüklerin kolayca yüklemek için modifiye edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Tendon ex vivo Mekanik Yükleniyor

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Tre Recombinase Moleküler Evrim

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...