Name: genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00
Duration: 7 min 32 s
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Il lavoro lievito nel laboratorio Pan è stato finanziato da una sovvenzione da Ajinomoto, Inc. in Giappone e National Institutes of Health di formazione di Grant T32GM007183-33. Ringraziamo il Dott. Ronald Wek presso la Scuola di Medicina dell&#39;Università dell&#39;Indiana di collaborazione a lungo termine sui progetti di lievito. Ringraziamo anche il dottor Kimberly Dittmar per lo sviluppo del tRNA carica metodo microarray.

Parte 1: Isolamento del totale tRNA carico <ol><li> Celle di pellet in una centrifuga da tavolo a 2000 RFC per 5 minuti. L&#39;equivalente di 1 OD 600 di cellule dovrebbero produrre almeno 1μg di RNA totale e un minimo di 30 mg è raccomandato per la procedura. </li><li> Risospendere le cellule in lisi soluzione tampone costituito da 0,3 M tamponato Na +-acetato (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex con un uguale volume di Na +-saturata di acetato di fenolo / cloroformio (pH 4,5) per tre volte ciascuno per 30 s. Essere sicuri di mantenere sempre i campioni in ghiaccio tra vortex. Acetato tamponata possono essere preparati da NaOAC e HOAc mentre acetato saturi fenolo / cloroformio può essere preparata mescolando 1 parte 5 M tampone acetato (pH 4.5) con 9 parti di fenolo / cloroformio. Nota: L&#39;RNA totale isolamento viene effettuato in condizioni leggermente acida e sul ghiaccio per evitare deacylation di tRNA carica. </li><li> Centrifugare a 18.600 RFC per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere lo strato acquoso ed eseguire un altro saturata di acetato di estrazione fenolo / cloroformio. </li><li> Dopo la seconda estrazione precipitare l&#39;RNA con l&#39;aggiunta di 2,7 x volumi di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere pellet di RNA in una soluzione tampone di lisi e poi precipitare con etanolo una seconda volta. </li><li> Infine, risospendere l&#39;RNA in una soluzione contenente 10 mM di acetato tamponata (pH 4,5) e 1 mM EDTA per il successivo trattamento. Il campione può essere stabilmente conservati a -80 ° C per circa due settimane. Lunga conservazione non è raccomandato in quanto alcuni tRNA carico inizierà a deacylate. </li></ol> Parte 2: elaborazione di norme tRNA <ol><li> Calore E. coli standard tRNA a 10,5 micron a 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7.5 per 2 minuti. Prendete il tubo e lasciare a temperatura ambiente per 3 minuti. </li><li> Aggiungi MgCl 2 a una concentrazione finale di 20 mm e incubare a 37 ° C per 5 minuti. </li><li> Aggiungere la miscela di reazione sintetasi così la reazione finale contiene 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitolo, 1,5 mM ATP, 1 mM spermina, 1 mM dei rispettivi amminoacidi, e 4,2 unità / mL E. coli-tRNA sintetasi mix. Incubare a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di 0,5 M acetato tamponata (pH 4,5) ed estrarre con saturata di acetato di fenolo / CHCl 3 a pH 4,5. </li><li> Precipitare gli standard tRNA con volumi 2,7 x di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere gli standard in 50 mM acetato tamponata (pH 4,5) con 1 mM EDTA e conservare a -80 ° C per un massimo di un mese. </li></ol> Parte 3: Cy3/Cy5 etichettatura dei tRNA <ol><li> Per il campione tRNA carico incubare RNA totale ad una concentrazione di 0,1 mg / mL con 0,066 mM ogni E. coli standard tRNA (cioè 0,67 pmole ogni standard per mcg RNA totale) e 100 mM di tampone acetato (pH 4,5) in presenza di 50 mM NaIO4 per 30 minuti a temperatura ambiente. Per il controllo totale del campione uso tRNA 50 mM NaCl al posto di NaIO4. Ricordati di diluire l&#39;RNA solo con soluzioni tampone per conservare la carica. </li><li> Per placare la reazione aggiungere il glucosio a 100 mm e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Al fine di rimuovere ogni residuo NaIO4 dal campione effettuare uno scambio di buffer utilizzando una colonna di spin G25. Per ottenere i migliori risultati equilibrare la prima colonna eseguendo 200 mM tampone tamponata (pH 4,5) attraverso di essa prima di applicare il vostro campione. </li><li> Precipitare il campione con l&#39;aggiunta di acetato tamponata (pH 4.5) ad una concentrazione finale di 133 mM e NaCl ad una concentrazione finale di 66 mm e 2,7 x volumi di etanolo. Occasionalmente una precipitazione secondo può essere necessaria per i campioni ossidati. Ciò è necessario solo se il pellet appare significativamente diversa rispetto al pellet di controllo del campione stesso. Ad esempio, una molto più grandi o più diffuso pellet. Se una precipitazione in etanolo secondo è necessario risospendere pellet in 50 mM tampone acetato pH 4.5 e 200 mM di NaCl prima dell&#39;aggiunta di etanolo. </li><li> Per deacylation i campioni tRNA sono risospesi in 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubate a 37 ° C per 30 min. La reazione è neutralizzato con l&#39;aggiunta di un uguale volume di 50 mM tampone acetato (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitato con 2,7 x volumi di etanolo. Dopo la precipitazione, l&#39;RNA è risospeso in acqua a circa 1 mg / mL. Sia il controllo e campioni ossidato deve essere eseguito su gel di agarosio per verificare la qualità dell&#39;RNA. </li><li> Per collegare i tag oligo fluorescenti sul tRNA 0,1 mg / mL di RNA deacylated è incubato in 1x buffer di ligasi, 15% DMSO, 4 mM Cy3 o Cy5 contenenti oligonucleotidi, 0,5 unità / mL DNA ligasi T4, e lievito exo-fosfatasi (5.000 unità / mL) a 16 ° C per una notte (oltre 16 h). L&#39;eso-fosfatasi è necessaria solo per i campioni ottenuti da lieviti e può essere omitted se questo protocollo è utilizzato per E. coli o di campioni umani. </li><li> Dopo la legatura campioni vengono miscelati con 4 volumi di 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e poi estratto con un uguale volume di fenolo / cloroformio. Dopo l&#39;estrazione della fase acquosa, le preparazioni di RNA sono precipitati con etanolo e risospeso in acqua per circa 0,1 mg / mL. </li><li> Efficienza legatura può essere valutato eseguendo il 5-10% dei campioni su gel di poliacrilammide 12% a base di urea 7M e visualizzate con uno scanner gel fluorescenti. Questa analisi PAGINA è utile anche per determinare la quantità di ossidato e campioni di controllo necessari per l&#39;ibridazione di microarray. Un buon risultato legatura dovrebbe mostrare ~ 10% o più del oligonucleotide Cy3/Cy5 contenente essere legatura al tRNA. Per i campioni con efficienza corretta etichettatura, 0,1-0,5 mg di RNA totale per campione è usato per l&#39;ibridazione di array. </li></ol> Parte 4: ibridazione e Analisi dei Microarray <ol><li> Prima di diapositive ibridazione microarray vengono bolliti in acqua distillata per 1-2 minuti per rimuovere oligonucleotidi non legati. </li><li> Cy3/Cy5 campioni etichettati sono combinati con 140 ml di buffer di ibridazione e DNA spermatico salmone ad una concentrazione finale di 140 mg / ml e poli (A) ad una concentrazione finale di 70 mg / ml. </li><li> Un programma di ibridazione, (tabella 1), viene eseguito su un Hybridizer serie automatica. Per lavori di tRNA, è altamente raccomandato che una macchina automatica ibridazione essere utilizzato in quanto l&#39;ibridazione manuale produce fondo elevato. </li><li> Dopo che il programma è completato manualmente lavare i vetrini con Lavare 3 soluzione almeno due volte agitando delicatamente in un tubo da 50 ml conica per 3-5 minuti. </li><li> Le diapositive possono essere essiccati mediante centrifugazione a bassa velocità, meno di 200 RFC, per 5-10 minuti. E &#39;importante mantenere le diapositive dalla luce poiché l&#39;esposizione alla luce la candeggina fluorofori. </li><li> Dopo le diapositive sono secchi devono essere acquisiti immediatamente per ottenere risultati ottimali, se necessario, possono essere salvati per diversi giorni in un luogo asciutto buio a temperatura ambiente. Le diapositive possono essere acquisiti 2-3 volte senza degradazione nella qualità dell&#39;immagine. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante Quando isolato correttamente il campione totale di RNA dovrebbe produrre uno spettro molto pulita con un 260 OD: OD 280 rapporto vicino a 2. Non ci dovrebbero essere proteine ​​rilevabili o contaminazione fenolo. Quando viene eseguito il 1% gel di agarosio, un gruppo forte tRNA devono essere osservati con altre band possibili acido nucleico che varia tra gli organismi. Dopo l&#39;ossidazione una band pulito tRNA devono essere osservati. Se un campione è notevolmente più debole di altri campioni o macchie si osserva, i campioni non devono essere utilizzati per microarray. Microarray dovrebbe avere sfondo molto basso, che è un ordine di grandezza inferiore a quello dei più deboli sonda tRNA. Elevato background è di solito a causa di problemi durante le fasi di lavaggio. Questo di solito può essere risolto preparando nuove soluzioni di lavaggio e lavaggio a fondo tutte le apparecchiature e le tubazioni per rimuovere residui e precipitato SDS. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Dettagli </td></tr><tr><td> O-ring di condizionamento </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Introdurre campione </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Esempio di denaturare </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Ibridazione </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavare 1 </td><td> 50 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr><tr><td> Lavare 2 </td><td> 42 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr><tr><td> Lavare 3 </td><td> 42 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: protocollo di ibridazione

<ol>
	<li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids.">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li><li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast.">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li><li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain.">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li><li>Cashel, M., Neidhardt, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stringent+Response.">The Stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma.">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per determinare simultaneamente i livelli relativi di carica di tutti i tRNA su scala genomica. Il protocollo presentato qui è stato ottimizzato per S. cerevisiae, ed è anche stato utilizzato con successo per misurare profili tRNA carica in E. coli e colture di cellule umane. Può essere modificato per adattarsi a qualsiasi organismo con una sequenza genomica nota (che consente per l&#39;annotazione di tutti i geni tRNA) finché totale tRNA carica può essere ottenuto.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microspin G-25 columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>25-5325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNAPhe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R3143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNATyr</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R0258</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNALys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli aminoacyl-tRNA synthetases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A3646</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>70042X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PerfectHyb Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H-7033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyb4 station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Digilab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 6.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays

aminoacylation tRNA, o la ricarica, i livelli possono cambiare rapidamente all&#39;interno di una cellula in risposta all&#39;ambiente [1]. Cambiamenti nei livelli di tRNA di ricarica nelle cellule, sia procarioti ed eucarioti portare alla regolamentazione traslazionale, che è un importante meccanismo di risposta allo stress cellulare. Esempi familiari sono la risposta a rigorosi<em&gt; E. coli</em&gt; E il percorso Gcn2 risposta allo stress nel lievito ([2-6]). Recenti lavori in<em&gt; E. coli</em&gt; E<em&gt; S. Saccharomyces</em&gt; Hanno dimostrato che i modelli di tRNA di ricarica sono molto dinamici e dipende dal tipo di stress sperimentato dalle cellule [1, 6, 7]. La altamente dinamico, la natura variabile del tRNA ricarica rende indispensabile per determinare i cambiamenti nei livelli di tRNA carica su scala genomica, al fine di chiarire completamente la risposta cellulare alle variazioni ambientali. In questa recensione vi presentiamo un metodo per misurare simultaneamente i livelli relativi di carica di tutti i tRNA in<em&gt; S. Saccharomyces</em&gt;. Mentre il protocollo presentato qui è per il lievito, questo protocollo è stato applicato con successo per determinare relativi livelli di carica in una grande varietà di organismi tra cui<em&gt; E. coli</em&gt; E le culture di cellule umane [7, 8].

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Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Descriviamo un metodo per l&#39;analisi di microarray per determinare i livelli aminoacylation relativa di tutti i tRNA da<em&gt; S. cerivisiae.</em

Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

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Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

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