Name: genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00
Duration: 7 min 32 s
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O trabalho de fermento no laboratório Pan foi financiado por uma doação da Ajinomoto, Inc. Japão e National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Agradecemos ao Dr. Ronald Wek na Escola de Medicina da Universidade de Indiana para a colaboração a longo prazo sobre os projetos de levedura. Agradecemos também a Dra. Kimberly Dittmar para o desenvolvimento do método de carregamento tRNA microarray.

Parte 1: Isolamento de tRNA cobrados total de <ol><li> Células sedimento em uma centrífuga de mesa em 2000 RFC por 5 minutos. O equivalente a 1 600 OD de células deve produzir pelo menos 1μg de RNA total e um mínimo de 30 mg é recomendado para o procedimento. </li><li> Ressuspender as células em solução tampão de lise constituído por 0,3 M tampão acetato de Na + (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex com igual volume de acetato de Na +-saturada de fenol / clorofórmio (pH 4,5) três vezes para cada 30 s. Certifique-se sempre manter as amostras em gelo entre vórtex. Acetato de tampão pode ser preparada a partir de NaOAC e HOAc enquanto saturada de acetato de fenol / clorofórmio pode ser preparado pela mistura de 1 parte 5 M tampão acetato (pH 4,5) com 9 partes de fenol / clorofórmio. Nota: o isolamento do RNA total é realizada sob condições levemente ácidas e no gelo para evitar deacylation de tRNA carregado. </li><li> Centrifugar a 18.600 RFC por 15 minutos a 4 ° C. Remover a camada aquosa e executar a nova extracção de acetato saturada de fenol / clorofórmio. </li><li> Após a segunda extração precipitar o RNA, adicionando volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Pellets ressuspender RNA em solução tampão de lise e precipitado com etanol pela segunda vez. </li><li> Finalmente, ressuspender o RNA em uma solução contendo 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) e 1 mM EDTA para posterior tratamento. A amostra pode ser armazenada de maneira estável a -80 ° C por cerca de duas semanas. Prolongar o armazenamento não é recomendado como alguns tRNA carregado vai começar a deacylate. </li></ol> Parte 2: Elaboração de Normas de tRNA <ol><li> Calor E. padrões coli tRNA em 10,5 M a 85 ° C em 45 mM Tris-Cl pH 7,5 por 2 minutos. Pegue o tubo e deixe em temperatura ambiente por 3 minutos. </li><li> Adicionar MgCl 2 a uma concentração final de 20 mM e incubar a 37 ° C por 5 minutos. </li><li> Adicione a mistura de reacção sintetase para a reação final contém 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM espermina, 1 mM dos respectivos aminoácido, e 4,2 unidades / mL E. coli mix sintetase aminoacil-tRNA. Incubar a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Adicionar um volume igual de 0,5 M de acetato tampão (pH 4.5) e extrair com acetato saturada de fenol / CHCl 3 em pH 4.5. </li><li> Precipitar os padrões tRNA com volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as normas em 50 mM tampão acetato (pH 4,5) com 1 mM EDTA e armazenar a -80 ° C por até um mês. </li></ol> Parte 3: Cy3/Cy5 rotulagem de tRNA <ol><li> Para a amostra tRNA cobrado incubar RNA total a uma concentração de 0,1 g / mL com 0,066 mM cada E. coli tRNA padrões (ie pmole 0,67 mg por cada padrão de RNA total) e 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) na presença de 50 mM NaIO4 por 30 minutos em temperatura ambiente. Para controlar o uso total da amostra tRNA 50 mM NaCl no lugar de NaIO4. Lembre-se de diluir o RNA apenas com soluções tamponadas para preservar a carregar. </li><li> Para matar a reação de glicose para adicionar 100 mM e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> , A fim de remover qualquer NaIO4 restante da amostra realizar uma troca de buffer usando uma coluna de spin G25. Para melhores resultados equilibrar a primeira coluna, executando 200 mM tampão acetato tamponado (pH 4,5) por ele antes de aplicar a sua amostra. </li><li> Precipitar a amostra pela adição de acetato tamponado (pH 4,5) para uma concentração final de 133 mM e NaCl para uma concentração final de 66 mM e 2,7 x volumes de etanol. Ocasionalmente, uma segunda precipitação podem ser necessários para as amostras oxidadas. Isso é necessário somente se o pellet parece significativamente diferente do pellet controle da mesma amostra. Por exemplo, um pellet significativamente maior ou mais difusa. Se uma precipitação etanol de segunda é necessária ressuspender pellet em 50 mM de acetato pH 4,5 e 200 mM NaCl antes da adição de etanol. </li><li> Para as amostras deacylation tRNA são suspensas em 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubados a 37 ° C por 30 min. A reação é neutralizado pela adição de igual volume de acetato 50 mM tampão (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitado com 2,7 x volumes de etanol. Após precipitação, o RNA é ressuspenso em água a ~ 1 mg / mL. Tanto o controle e as amostras oxidadas devem ser executados em gel de agarose para verificar a qualidade RNA. </li><li> Para anexar etiquetas fluorescentes oligo para o tRNA 0,1 mcg / mL de RNA deacylated é incubada em 1x tampão ligase, DMSO 15%, 4 mM Cy3 ou Cy5 contendo oligonucleotides, 0,5 unidades / mL DNA ligase T4, e leveduras exo-fosfatase (5.000 unidades / mL) a 16 ° C durante a noite (mais de 16 h). O exo-fosfatase é necessário apenas para as amostras obtidas a partir de leveduras e pode ser omitted se esse protocolo é utilizado para E. coli ou amostras humanas. </li><li> Após ligadura amostras são misturadas com 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e então extraído com um volume igual de clorofórmio fenol /. Após a extracção da fase aquosa, os preparativos estão RNA precipitado com etanol e ressuspenso em água a cerca de 0,1 mcg / mL. </li><li> Ligadura eficiência pode ser avaliada através da execução de 5-10% das amostras em gel de poliacrilamida 12% contendo uréia 7M e visualizado com um scanner gel fluorescente. Esta análise PAGE também é útil para determinar a quantidade de oxidado e amostras de controlo necessários para a hibridização microarray. Um resultado bom ligadura deve mostrar ~ 10% ou mais do oligonucleotídeo Cy3/Cy5 contendo sendo ligada ao tRNA. Para amostras com eficiência rotulagem bom, 0,1-0,5 mg RNA total por amostra é utilizada para a hibridização matriz. </li></ol> Parte 4: Hibridação e Análise do Microarray <ol><li> Antes de slides microarray de hibridização são fervidas em água destilada por 1-2 minutos para remover oligonucleotides desacoplado. </li><li> Cy3/Cy5 amostras rotuladas são combinados com 140 mL de tampão de hibridação e DNA de esperma de salmão para uma concentração final de 140 mg / ml e poli (A) para uma concentração final de 70 mcg / ml. </li><li> Um programa de hibridação, (tabela 1), é executado em uma variedade hybridizer automática. TRNA para o trabalho, é altamente recomendável que uma máquina automática de hibridização ser usado desde a hibridização produz manual de fundo de alta. </li><li> Depois que o programa está completo manualmente lavar as lâminas com solução de Lavar 3 pelo menos duas vezes agitando em um tubo de 50 ml por 3-5 minutos. </li><li> Slides pode ser secas por centrifugação a baixa velocidade, a menos de 200 RFC, por 5-10 minutos. É importante manter o desliza para fora da luz desde a exposição à luz alvejarão o fluoróforos. </li><li> Após as lâminas são secas que devem ser verificados imediatamente para melhores resultados, se necessário, eles podem ser salvos por vários dias em um lugar seco e escuro à temperatura ambiente. Slides podem ser digitalizados 2-3 vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante Quando isolados adequadamente a amostra de RNA total, deve produzir um espectro muito limpo, com uma 260 OD: OD relação de perto de 2 280. Não deve haver nenhuma proteína ou contaminação detectável fenol. Quando executado em gel agarose 1%, uma banda tRNA forte deve ser observado com outros possíveis bandas de ácido nucléico variando entre organismos. Após a oxidação de uma banda tRNA limpas devem ser observados. Se uma amostra é visivelmente mais fraco do que outras amostras ou manchas é observada, as amostras não devem ser usadas para microarrays. Microarrays devem ter fundo muito baixa, que é uma ordem de magnitude menor do que a sonda mais fraco tRNA. Elevado ruído de fundo é geralmente devido a problemas durante as etapas de lavagem. Isto normalmente pode ser corrigido através da preparação de soluções de lavagem fresca e lavar bem todos os equipamentos e tubulação para remover SDS residual e precipitado. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Detalhes </td></tr><tr><td> O-ring condicionado </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Apresentar amostra </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Exemplo de desnaturar </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Hibridização </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavar uma </td><td> 50 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr><tr><td> Lavar 2 </td><td> 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr><tr><td> Lavar 3 </td><td> 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Protocolo de hibridação

<ol>
	<li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids.">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li><li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast.">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li><li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain.">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li><li>Cashel, M., Neidhardt, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stringent+Response.">The Stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma.">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um método para determinar simultaneamente os níveis relativos de carga de todos os tRNAs em escala genômica. O protocolo aqui apresentado foi otimizado para S. cerevisiae, e também tem sido utilizado com sucesso para medir perfis de carga tRNA em E. coli e culturas de células humanas. Ele pode ser modificado para acomodar qualquer organismo com seqüências do genoma conhecido (permitindo a anotação de todos os genes tRNA), desde que tRNA cobrados total pode ser obtida.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microspin G-25 columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>25-5325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNAPhe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R3143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNATyr</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R0258</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNALys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli aminoacyl-tRNA synthetases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A3646</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>70042X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PerfectHyb Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H-7033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyb4 station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Digilab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 6.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays

tRNA aminoacylation, ou carga, os níveis podem mudar rapidamente dentro de uma célula em resposta ao ambiente [1]. Mudanças nos níveis de carregamento tRNA em células procariotas e eucariotas levar a regulação de translação que é um dos principais mecanismos celulares de resposta ao estresse. Exemplos familiares são a resposta rigorosa em<em&gt; E. coli</em&gt; Eo Gcn2 via resposta ao estresse em leveduras ([2-6]). Trabalhos recentes na<em&gt; E. coli</em&gt; E<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Têm mostrado que os padrões de tRNA carga são extremamente dinâmica e depende do tipo de stress experimentado pelas células [1, 6, 7]. A natureza altamente dinâmico, variável de tRNA de carregamento torna essencial para determinar mudanças nos níveis de tRNA de carregamento em escala genômica, a fim de elucidar totalmente resposta celular a variações ambientais. Nesta revisão, apresentamos um método para medir simultaneamente os níveis relativos de carga de todos os tRNAs em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Enquanto o protocolo aqui apresentado é para o fermento, este protocolo tem sido aplicado com sucesso para determinar níveis de carga em relação em uma ampla variedade de organismos, incluindo<em&gt; E. coli</em&gt; E culturas de células humanas [7, 8].

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Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Nós descrevemos um método para análise de microarray para determinar os níveis aminoacylation relação de todos os tRNAs de<em&gt; S. cerivisiae.</em

Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Research

JoVE Journal

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Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

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