Name: genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays at JoVE.com

Дрожжи работать в лаборатории Пан был профинансирован за счет гранта Ajinomoto, Inc Японии и Национального института здоровья Обучение Грант T32GM007183-33. Мы благодарим д-ра Рональда Век школы Университета Индианы медицины для долгосрочного сотрудничества по дрожжей проектов. Мы также благодарим доктора Кимберли Диттмар для разработки тРНК зарядки микрочипов метод.

Часть 1: Изоляция от общего числа заряженных тРНК <ol><li> Гранул клеток в настольной центрифуге при 2000 RFC течение 5 минут. Эквивалент 1 OD 600 из клетки должны производить не менее 1 мкг тотальной РНК и не менее 30 мкг рекомендуется для процедуры. </li><li> Ресуспендируют лизис клеток в буферный раствор, состоящий из 0,3 М буфере Na +-ацетат (рН 4,5) и 10 мМ ЭДТА. Vortex с равным объемом Na +-ацетат-насыщенных фенол / хлороформ (рН 4,5) три раза в течение 30 сек Будьте уверены, чтобы всегда держать образцы на льду между вортексе. Буферизацией ацетат можно приготовить из NaOAc и HOAc в то время как ацетат насыщенных фенол / хлороформ можно приготовить, смешав 1 часть 5 М буфере ацетат (рН 4,5) с 9 частями фенол / хлороформ. Примечание: полная изоляция РНК осуществляется при умеренно кислой среде и на льду, чтобы избежать деацилирования заряженных тРНК. </li><li> Центрифуга в RFC 18600 в течение 15 минут при 4 ° C. Удалить водный слой и совершать другие ацетат насыщенных фенол / хлороформ добычи. </li><li> После второго добычи осадок РНК, добавив 2,7 раза объемов этанола и центрифугированием при 18600 RFC в течение 30 минут при 4 ° C. </li><li> Ресуспендируют РНК гранул в лизис буферный раствор, а затем осадок с этанолом второй раз. </li><li> Наконец, ресуспендируют РНК в растворе, содержащем 10 мМ буфере ацетата (рН 4,5) и 1 мМ ЭДТА для последующего лечения. Образец может быть стабильно хранится при температуре -80 ° С в течение около двух недель. Длительного хранения не рекомендуется, поскольку некоторые заряженных тРНК начнет deacylate. </li></ol> Часть 2: Подготовка тРНК стандартам <ol><li> Тепло Е. кишечной тРНК стандартов на 10,5 мкМ до 85 ° С в 45 мМ Трис-Cl рН 7,5 в течение 2 минут. Возьмите трубку и оставить при комнатной температуре в течение 3 минут. </li><li> Добавить MgCl 2 до конечной концентрации 20 мМ и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 минут. </li><li> Добавить смесь синтетазы реакции так окончательной реакции содержит 5 мкМ тРНК, 60 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 12,5 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl, 3 мМ дитиотреитол, 1,5 мМ АТФ, 1 мМ спермина, 1 мМ соответствующих аминокислоты, и 4,2 ЕД / мкл Е. кишечной аминоацил-тРНК-синтетазы смеси. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 минут. </li><li> Добавить равный объем 0,5 М буфере ацетат (рН 4,5) и экстракт с ацетат-насыщенных фенол / CHCl 3 при рН 4,5. </li><li> Осадок тРНК стандартов с 2,7 раза объемов этанола и центрифугированием при 18600 RFC в течение 30 минут при 4 ° C. </li><li> Ресуспендируют стандартов в 50 мМ буфере ацетата (рН 4,5) с 1 мМ ЭДТА и хранить при температуре -80 ° С на срок до одного месяца. </li></ol> Часть 3: Cy3/Cy5 маркировки тРНК <ol><li> Для заряженных тРНК образец инкубировать общей РНК в концентрации 0,1 мкг / мкл 0,066 мкМ каждого E. кишечной тРНК стандартам (то есть 0,67 пмоль каждого стандарта на мкг тотальной РНК) и 100 мМ буфере ацетата (рН 4,5) в присутствии 50 мМ NaIO4 в течение 30 минут при комнатной температуре. Для управления общей выборки тРНК использовать 50 мМ NaCl вместо NaIO4. Не забудьте разбавить РНК только с буферных растворов для сохранения зарядки. </li><li> Утолить реакция добавить глюкозу до 100 мм и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут. </li><li> Для того, чтобы удалить все оставшиеся NaIO4 из образца выполняют буфер обмена использованием колонки G25 спина. Для достижения наилучших результатов равновесие колонке первым, выполнив 200 мМ буфером ацетатный буфер (рН 4,5) через него перед нанесением вашего образца. </li><li> Осадок образца, добавив буфер ацетат (рН 4,5) до конечной концентрации 133 мМ NaCl и до конечной концентрации 66 мМ и 2,7 раза объемов этанола. Иногда второй осадков могут быть необходимы для окисленных образцов. Это необходимо, только если гранулы выглядит значительно отличается от управления гранул одного и того же образца. Например значительно больше или диффузный гранул. Если второй осадков этанола требуется ресуспендирования гранул в 50 мМ ацетатного буфера рН 4,5 и 200 мМ NaCl перед добавлением этанола. </li><li> Для деацилирования тРНК образцы ресуспендируют в 50 мМ Трис-HCl (рН 9) и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Реакции нейтрализуется добавлением равного объема 50 мМ буфере ацетата (рН 4,5) и 100 мМ NaCl. Осадок с 2,7 раза объемов этанола. После осаждения РНК ресуспендировали в воде при температуре ~ 1 мкг / мкл. Оба контроля и окисленные образцы должны быть запущены на гелях агарозы и проверить РНК качества. </li><li> Для присоединения флуоресцентных меток олиго на тРНК 0,1 мкг / мкл деацилированная РНК инкубировали в 1x лигазы буфера, 15% ДМСО, 4 мкМ Cy-3-или Cy5 олигонуклеотидов, 0,5 ед / мкл T4 ДНК-лигазы и дрожжи экзо-фосфатазы (5000 ед. / мкл) при 16 ° С в течение ночи (более 16 ч). Экзо-фосфатазы необходимо только для образцов, полученных из дрожжей и может быть omitteг, если этот протокол используется для E. палочки или человеческих образцов. </li><li> После перевязки образцы смешиваются с 4-х томах 50 мМ KOAc (рН 7), 200 мМ KCl, а затем экстрагируют равным объемом фенол / хлороформ. После извлечения из водной фазы, РНК препараты осаждали этанолом и ресуспендировали в воде около 0,1 мкг / мкл. </li><li> Лигирование эффективность можно оценить, запустив 5-10% образцов на 12% полиакриламидном гелей, содержащих 7М мочевина и визуализированы с люминесцентными сканер геля. Это СТРАНИЦА анализ также полезен для определения количества окисленных и контрольные образцы необходимых для гибридизации микрочипов. Хороший результат должен показать перевязки ~ 10% или более Cy3/Cy5 содержащие олигонуклеотидные быть лигировали с тРНК. Для образцов с высокой эффективностью маркировки, 0,1-0,5 мкг тотальной РНК в образце используется для массива гибридизации. </li></ol> Часть 4: гибридизация и анализ Microarray <ol><li> До слайды гибридизации микрочипов кипятят в дистиллированной воде в течение 1-2 минут для удаления несвязанных олигонуклеотидов. </li><li> Cy3/Cy5 меченых образцов в сочетании с 140 мкл буфера гибридизации и ДНК спермы лосося в конечной концентрации 140 мкг / мл и поли (А) до конечной концентрации 70 мкг / мл. </li><li> Гибридизации программы (таблица 1), выполняется на автоматических гибридизатора массива. Для работы тРНК, настоятельно рекомендуется, чтобы автомат гибридизации быть использованы с ручной гибридизации производит высококачественные фоне. </li><li> После завершения программы вручную мыть слайды с Вымойте 3 Решение по крайней мере дважды, осторожно встряхивая в 50 мл коническую трубку в течение 3-5 минут. </li><li> Слайды можно сушить центрифугированием при низкой скорости, менее 200 RFC, в течение 5-10 минут. Важно сохранить слайды из света с воздействием света будет отбеливатель флуорофоров. </li><li> После слайды сушатся они должны быть отсканированы сразу для достижения оптимального результата, при необходимости они могут быть сохранены в течение нескольких дней в сухом темном месте при комнатной температуре. Слайды могут быть отсканированы в 2-3 раза без заметного ухудшения качества изображения. </li></ol> Часть 5: Представитель Результаты При изолированной должным образом общая выборка РНК должна производить очень чистый спектр с OD 260: диаметр 280 соотношение около 2. Там должно быть не обнаруживается белок или фенол загрязнения. При запуске на 1% агарозном гелях, сильная полоса тРНК должны быть соблюдены с другими возможными нуклеиновые кислоты полос различной между организмами. После окисления чистой группы тРНК должны быть соблюдены. Если образец заметно слабее, чем у других образцов или размытие наблюдается, образцы не должны использоваться для микрочипов. Microarrays должны иметь очень низкий фон которая на порядок ниже, чем слабые зонд тРНК. Высокий фон, как правило, из-за проблем во время промывки. Обычно это может быть установлена ​​путем подготовки свежие решения и тщательно мыть стиральную все оборудование и трубопроводы для удаления остатков и осаждают SDS. <table border="1"><tbody><tr><td> Шаг </td><td> Детали </td></tr><tr><td> Уплотнительное кольцо кондиционирования </td><td> 75 ° C, 2 мин </td></tr><tr><td> Ввести образца </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Пример денатурировать </td><td> 90 ° C, 5 мин </td></tr><tr><td> Гибридизация </td><td> 60 ° С, 16 ч </td></tr><tr><td> Промыть 1 </td><td> 50 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы </td></tr><tr><td> Вымойте 2 </td><td> 42 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы </td></tr><tr><td> Вымойте 3 </td><td> 42 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы </td></tr></tbody></table> Таблица 1: гибридизация протокола

<ol>
	<li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids.">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li><li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast.">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li><li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li><li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain.">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li><li>Cashel, M., Neidhardt, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stringent+Response.">The Stringent Response.</a> Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma.">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы представляем метод одновременного определения относительного уровня зарядки всех тРНК в геномной шкале. Протокол, представленные здесь была оптимизирована для S. CEREVISIAE, и она также успешно используется для измерения тРНК зарядки профилей в E. палочки и человеческих клеточных культурах. Она может быть изменена, чтобы приспособить любой организм, известный геномных последовательностей (с учетом аннотации всех генов тРНК) до тех пор, как общее заряженных тРНК может быть получена.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microspin G-25 columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>25-5325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNAPhe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R3143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNATyr</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R0258</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNALys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli aminoacyl-tRNA synthetases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A3646</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>70042X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PerfectHyb Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H-7033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyb4 station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Digilab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 6.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

genome-wide analysis of aminoacylation (charging) levels of trna using microarrays

тРНК аминоацилирования или зарядки, уровни могут быстро меняться в клетке в ответ на окружающую среду [1]. Изменения в тРНК уровень заряда как в прокариотических и эукариотических клеток приводят к поступательным регулирования, которая является одним из основных сотовых механизм стресса. Знакомые примеры строгого ответа в<em&gt; Е. палочки</em&gt; И Gcn2 стрессовую реакцию путь в дрожжах ([2-6]). Последние работы в<em&gt; Е. палочки</em&gt; И<em&gt; С. CEREVISIAE</em&gt; Показали, что тРНК зарядки образцы высокой динамичностью и зависит от типа стресса испытывает клеток [1, 6, 7]. Очень динамичный, изменчивый характер тРНК зарядку делает необходимым для определения изменений в тРНК уровень заряда на геномной масштабе, с тем чтобы полностью выяснить клеточный ответ на экологические изменения. В этом обзоре мы представляем метод одновременного измерения относительного уровня зарядки всех тРНК в<em&gt; С. CEREVISIAE</em&gt;. Хотя протокол, представленные здесь, на дрожжах, этот протокол был успешно применен для определения относительного уровня зарядки в самых разнообразных организмов, включая<em&gt; Е. палочки</em&gt; И человеческих культурах клеток [7, 8].

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays at JoVE.com

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Мы опишем метод микрочипов анализ для определения относительного уровня аминоацилирования всех тРНК<em&gt; С. cerivisiae.</em

Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Роман байесовского Изменение точки Алгоритм всему геному анализ различных типов данных ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Полисом фракционирования и анализ млекопитающих Translatomes на генома масштабе

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...