بعد زراعة عينة الدم المذابة المحفوظة بالتبريد ، قم بتشعيعها بجرعات الأشعة السينية المطلوبة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 1.62 ملليلتر من وسط ثقافة RPMI الدافئ إلى كل بئر. لتحفيز انقسام الخلايا في الخلايا الليمفاوية التائية ، أضف 40 ميكرولترا من phytohemagglutinin إلى كل بئر وأعد تعليقه جيدا.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 23 ساعة. في اليوم التالي ، أضف ثمانية ميكرولترات من السيتوكلاسين B لكل بئر لمنع التحريك الخلوي. بعد 70 ساعة ، أخرج اللوحة من الحاضنة وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر.
شطف كل بئر مع اثنين ملليلتر من PBS وإضافة هذا PBS إلى أنبوب 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 180 G لمدة ثماني دقائق وتجاهل المادة الطافية ، وترك 500 ميكرولتر فوق الحبيبات. أثناء دوامة الحبيبات ، أضف ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم البارد في الأنبوب.
مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل الطافع كما هو موضح سابقا. دوامة بيليه عن طريق إضافة ببطء ملليلتر من المثبت البارد 1 واحتضان بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل الطاف.
أثناء دوامة الحبيبات من حيث السقوط ، أضف ملليلتر من المثبت البارد 2 إلى الأنبوب. اترك الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. طرد مركزي العينة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر لتركيز الخلايا وفقا لحجم الحبيبات.
نظف الشرائح باستخدام الأيزوبروبانول وقم بتسميتها بشكل صحيح. بعد دوامة الحبيبات ، أضف 40 ميكرولترا من تعليق الخلية الثابتة على شريحة. بعد التجفيف ، اغمر الشريحة في بقعة برتقالية أكريدين لمدة دقيقة واحدة.
ثم اغسل الشريحة بسرعة بالماء المقطر قبل وضعها في مخزن مؤقت للفوسفات لمدة دقيقة واحدة. جفف الجزء الخلفي من الشريحة وضعه على مناديل ورقية نظيفة. أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفوسفات على الشريحة وقم بتغطيتها بغطاء نظيف ، وتجنب فقاعات الهواء.
ختم الشريحة مع الاسمنت السيليكون. ضع الشريحة تحت مجهر الفلورسنت وافحص الخلايا ثنائية النواة. أخيرا ، عد النوى الدقيقة يدويا.
يشير وجود خلايا ثنائية النواة مستديرة إلى استرجاع ناجح للخلايا السليمة القابلة للحياة من عينات الدم الكامل المحفوظة بالتبريد. مع زيادة جرعات الإشعاع ، لوحظت زيادة خطية تربيعية في إنتاجية النواة الدقيقة. نتجت غلة النواة الدقيقة الخلفية في عينات التحكم المشععة الوهمية في المقام الأول عن الكروموسومات المتأخرة.
