해동된 냉동 보존된 혈액 샘플을 배양한 후 실온에서 필요한 X선 선량을 조사합니다. 그런 다음 각 웰에 1.62ml의 따뜻한 RPMI 배양 배지를 추가합니다. T 림프구의 세포 분열을 자극하려면 각 웰에 40마이크로리터의 피토헤마글루티닌을 첨가하고 완전히 재현탁합니다.
접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 23시간 동안 배양합니다. 다음 날, 사이토카인시스를 차단하기 위해 웰당 8마이크로리터의 사이토칼라신 B를 추가합니다. 70시간 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.
PBS 2밀리리터로 각각을 잘 헹구고 이 PBS를 15밀리리터 튜브에 넣습니다. 셀 현탁액을 180G에서 8분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 펠릿 위에 500마이크로리터를 남깁니다. 펠릿을 소용돌이치면서 차가운 염화칼륨 2ml를 튜브에 넣습니다.
다시 말하지만, 이전에 설명한 대로 상층액을 원심분리하고 폐기합니다. 콜드 고정제 1 2 밀리리터를 천천히 첨가하여 펠릿을 소용돌이 치게하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 원심 분리하여 상층액을 버립니다.
펠릿을 방울 방향으로 소용돌이치면서 2ml의 콜드 고착제 2를 튜브에 추가합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 그대로 두십시오. 샘플을 원심분리하고 상층액을 다른 튜브로 옮겨 펠릿 크기에 따라 세포를 농축합니다.
이소프로판올로 슬라이드를 청소하고 적절하게 라벨을 붙입니다. 펠릿을 소용돌이친 후 40마이크로리터의 고정 셀 현탁액을 슬라이드에 추가합니다. 건조 후 슬라이드를 아크리딘 오렌지 얼룩에 1분 동안 담그십시오.
그런 다음 슬라이드를 증류수로 빠르게 씻은 후 인산염 완충액에 1분 동안 넣습니다. 슬라이드 뒷면을 말리고 깨끗한 티슈 페이퍼 위에 놓습니다. 슬라이드에 20마이크로리터의 인산염 완충액을 추가하고 기포를 방지하여 깨끗한 커버 슬립으로 덮습니다.
실리콘 시멘트로 슬라이드를 밀봉하십시오. 슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓고 이핵 세포를 검사합니다. 마지막으로 수동으로 소핵을 계산합니다.
둥근 이핵 세포의 존재는 냉동 보존된 전혈 샘플에서 건강한 생존 가능한 세포를 성공적으로 회수했음을 나타냅니다. 방사선량의 증가와 함께, 소핵 수율의 선형 2차 증가가 관찰되었습니다. 가짜 방사선 조사된 대조군 샘플의 배경 소핵 수율은 주로 지연된 염색체에서 비롯됩니다.
