Name: High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format
Uploaded: 2024-02-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format at JoVE.com

high-throughput screening of compounds using neutrophils isolated from human blood in a 384-well plate format

فحص مثبطات تنشيط الإنتيرين β2 في العدلات البشرية

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير طريقة لتحديد الخصوم الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 Integrin 

تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين

Our research is focused on neutrophil integrin, and in this study we aim to establish a method to find small molecular antagonists of Beta-2 integrin activation. We believe with this method we can find new antagonists that may deepen our understanding in integrin physiology, and also provide translational insight into integrin-based anti-inflammatory therapy. In the future, we will focus on discovering new anti-inflammatory drugs and dissecting their mechanisms of action.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format at JoVE.com

High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format  

فحص عالي الإنتاجية للمركبات باستخدام العدلات المعزولة من دم الإنسان في شكل صفيحة 384 بئرا

باستخدام ماصة مصلية ، ضع بعناية أربعة ملليلتر من الدم البشري الهيبارين على ثمانية ملليلتر من وسط تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الدم في 550G لمدة 30 إلى 50 دقيقة عند 20 درجة مئوية. ثم استخدم ماصة ملليلتر واحد لإزالة الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والخلايا أحادية النواة.اجمع العدلات من النطاق الغائم السفلي وحوالي ثلاثة إلى أربعة ملليلتر تحت السائل الصافي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من PBS. اقلب الأنبوب برفق مرتين إلى ثلاث مرات لخلط تعليق العدلات. أجهزة الطرد المركزي تعليق العدلات عند 400G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ثم صب بعناية المادة الطافية من الأنبوب وإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS.مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، استخدم الشفط الفراغي للتخلص من الطافات المتبقية على جدار الأنبوب وحول فم الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط العدلات.اجمع بين ملليلتر واحد من 1.2 ميكروغرام لكل محلول أجسام مضادة ملليلتر مع 0.2 ملليلتر من وسط العدلات في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة إلى آبار التحكم السلبي في لوحة بئر 384. في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، اجمع بين تسعة ملليلتر من محلول الأجسام المضادة ، و 21.6 ميكرولتر من محلول FMLP ، و 1.7784 ملليلتر من وسط العدلات.أضف 25 ميكرولترا من هذا الخليط إلى آبار التحكم الإيجابية والاختبار في صفيحة بئر 384. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل خمسة ميكرولترات من المحلول المركب من لوحة المكتبة المركبة إلى لوحة البئر 384. أجهزة الطرد المركزي التعليق في 500G لمدة دقيقة واحدة.أضف 20 ميكرولترا من تعليق العدلات إلى كل بئر باستخدام ماصة 16 قناة. احتضان اللوحة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ثم لإصلاح الخلايا ، أضف ثلاثة ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.

high-throughput-screening-compounds-using-neutrophils-isolated-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.