Utilizzando una pipetta sierologica, stratificare accuratamente quattro millilitri di sangue umano eparinizzato su otto millilitri di mezzo a gradiente di densità in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare il sangue a 550 g per 30-50 minuti a 20 gradi Celsius. Quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere lo strato superiore contenente plasma e cellule mononucleate.
Raccogliere i neutrofili dalla banda torbida inferiore e circa tre o quattro millilitri sotto il liquido limpido in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS. Capovolgere delicatamente il tubo due o tre volte per mescolare la sospensione dei neutrofili. Centrifugare la sospensione di neutrofili a 400G per 10 minuti a 20 gradi Celsius, quindi travasare con cura il surnatante dalla provetta e risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS.
Anche in questo caso, centrifugare la sospensione a 300 G per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare l'aspirazione a vuoto per eliminare il surnatante residuo sulla parete del tubo e intorno alla bocca del tubo. Risospendere il pellet in un millilitro di mezzo neutrofilo.
Combinare un millilitro di soluzione anticorpale da 1,2 microgrammi per millilitro con 0,2 millilitri di terreno neutrofilo in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di soluzione anticorpale ai pozzetti di controllo negativo in una piastra da 384 pozzetti. In una provetta da 15 millilitri, unire nove millilitri della soluzione anticorpale, 21,6 microlitri della soluzione FMLP e 1,7784 millilitri di mezzo neutrofilo.
Aggiungere 25 microlitri di questa miscela ai pozzetti di controllo positivo e di prova in una piastra da 384 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire cinque microlitri di soluzione composta dalla piastra della libreria composta alla piastra da 384 pozzetti. Centrifugare la sospensione a 500G per un minuto.
Aggiungere 20 microlitri di sospensione di neutrofili a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a 16 canali. Incubare la piastra su uno shaker a 300 RPM per 10 minuti. Quindi, per fissare le cellule, aggiungere tre microlitri di paraformaldeide al 16% in ciascun pozzetto e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
