Name: Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
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explant culture and platforms loading to study the biologic sequelae of tendon impingement

कण्डरा प्रभाव को समझना - मेकेनोबायोलॉजी के अध्ययन के लिए मुराइन एक्सप्लांट मॉडल

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

लेखक स्पॉटलाइट: कण्डरा इम्पिंजमेंट के मेकेनोबायोलॉजी को उजागर करना - एक बहुअक्षीय म्यूरिन हिंद लिंब एक्सप्लांट मॉडल 

Achilles कण्डरा Impingement के मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए Murine हिंद लिंब एक्सप्लांट मॉडल

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

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Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement  

कण्डरा इम्पिंजमेंट के जैविक अनुक्रम का अध्ययन करने के लिए एक्सप्लांट कल्चर और प्लेटफॉर्म लोड हो रहा है

शुरू करने के लिए, पर्याप्त मात्रा में बाँझ संस्कृति मीडिया को पहले से गरम करें, जबकि 48 घंटे का डेक्सामेथासोन प्रीट्रीटमेंट म्यूरिन हिंडलिंब एक्सप्लांट पूरा होने वाला है। एक बार प्रीट्रीटमेंट समाप्त हो जाने के बाद, प्रीट्रीटेड एक्सप्लांट्स को बायोसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं। अनलोडेड समूह के लिए, pretreatment मीडिया aspirate और ताजा पेट्री व्यंजन के लिए explants हस्तांतरण.इनक्यूबेटर में लौटने से पहले प्रत्येक डिश में 70 मिलीलीटर कल्चर मीडिया जोड़ें। आधारभूत तनाव और स्थैतिक टकराव समूह के लिए एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म तैयार करने के लिए, ग्रिप प्लैटेंस के आकार से मेल खाने के लिए सैंडपेपर के टुकड़ों को काट लें। स्थैतिक टकराव समूह के लिए, लट में रेखा के टुकड़े काट लें और लाइन की लंबाई के साथ आधे रास्ते में एक ढीले ओवरहैंड गाँठ को बाँध दें।प्रत्येक ऐक्रेलिक स्नान को कवर करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के टुकड़े फाड़ें और उन्हें 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। तैयार घटकों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। ऐक्रेलिक स्नान, आधार, वॉल्यूम में कमी आवेषण, क्लिप और प्लेटफॉर्म असेंबली के लिए पकड़ जैसे घटकों को व्यवस्थित करें।किसी भी संभावित संस्कृति मीडिया लीक को रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा के माध्यमिक कंटेनरों के अंदर प्लेटफ़ॉर्म घटकों को रखें। कंटेनरों को कम से कम एक घंटे के लिए कम से कम 10% ब्लीच के घोल में डुबोएं। नल के पानी के साथ ब्लीच समाधान कुल्ला।धुले हुए घटकों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करने के बाद, प्लैटेंस को पकड़ में चिपकाने के लिए एम 3 स्क्रू और संपीड़न स्प्रिंग्स का उपयोग करें। M5 स्क्रू नियोजित करने वाले आधार पर ग्रिप्स को सुरक्षित रूप से संलग्न करें और M6 स्क्रू को तब तक डालें जब तक कि वे प्लैटेंस से संपर्क न कर लें। दो तरफा टेप का उपयोग करके सैंडपेपर चिपकाकर प्लैटेंस की कार्यक्षमता बढ़ाएं।प्लैटेंस को सैंडपेपर के आसंजन की सुविधा के लिए पकड़ बंद करें। एक मंच लोड करने के लिए, पूरी तरह से पकड़ खोलने के लिए और ध्यान से ऊपरी पैर और प्लैटेंस के बीच घुटने की स्थिति के लिए संदंश का उपयोग करें. अंग को जगह में रखने के लिए धीरे से पकड़ बंद करें।उजागर ऊरु सिर या पैर समझ और घुटने फ्लेक्सन कोण को समायोजित करने के लिए संदंश का प्रयोग करें, जबकि धीरे-धीरे संदंश बंद करने के लिए यह जगह में सुरक्षित. आधारभूत तनाव समूह के लिए, पकड़ को बंद करते हुए घुटने के जोड़ का विस्तार करें। स्थैतिक टकराव समूह के मामले में, पकड़ को बंद करते हुए घुटने के जोड़ को फ्लेक्स करें।स्थैतिक टकराव समूह के लिए, बाहर का पंजा के चारों ओर स्ट्रिंग के ओवरहैंड गाँठ जगह है और यह सुरक्षित रूप से कस लें. स्ट्रिंग को एक्सप्लांट के नीचे बेस में एक स्लॉट के माध्यम से और क्लिप होल के माध्यम से रूट करें। ऐक्रेलिक स्नान में आधार की स्थिति और स्नान के शीर्ष किनारे पर क्लिप जकड़ना।पैर को डॉर्सिफ्लेक्स करने के लिए, स्ट्रिंग को तब तक खींचें जब तक कि यह टिबिया के सापेक्ष कम से कम 110 डिग्री तक न पहुंच जाए। स्ट्रिंग को क्लिप से बाहर निकलते ही चिह्नित करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें। dorsiflexion कोण के भविष्य की मात्रा का ठहराव के लिए इस dorsiflexed स्थिति में explant की एक तस्वीर पर कब्जा.सेटअप से आधार निकालें और मात्रा में कमी डालने के आधार पर एक ट्रैक के साथ यह स्लाइड द्वारा देते हैं. आधार को ऐक्रेलिक स्नान में वापस रखें और क्लिप को शीर्ष किनारे पर रखें। एक गाइड के रूप में चिह्नित स्ट्रिंग का उपयोग करें।पैर को उसके मूल पृष्ठीय कोण पर पुनर्स्थापित करने के लिए इसे खींचें और एक स्थिर पृष्ठीय स्थिति बनाए रखने के लिए टेप का उपयोग करके स्ट्रिंग को स्नान के बाहरी हिस्से में सुरक्षित करें। आधारभूत तनाव समूह के लिए, एक बार जब एक्सप्लांट पकड़ के बीच स्थित होता है, तो पृष्ठीय कोण को मापने के लिए एक तस्वीर लें। फिर वॉल्यूम रिडक्शन इंसर्ट को बेस पर स्लाइड करें और इसे ऐक्रेलिक बाथ में रखें।एक्सप्लांट्स को जलमग्न करने के लिए प्रत्येक प्लेटफॉर्म पर 125 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड कल्चर मीडिया जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्नान के शीर्ष को कवर करने के बाद, पूरे सेटअप को एक माध्यमिक कंटेनर में रखें। सात दिनों के लिए इनक्यूबेटर और संस्कृति के लिए माध्यमिक कंटेनर को स्थानांतरित करें।

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Bioengineering

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...