Commencez par placer les sections de cerveau fixées au formol et enrobées de paraffine dans des plats avec des couvercles à vis. Fixez la solution d’arrêt à la vaisselle, couvrez-la de papier d’aluminium et incubez à quatre degrés Celsius tout en agitant pendant une journée. Le lendemain, transférez tous les échantillons dans de nouvelles boîtes et incubez-les avec la solution d’activation comme indiqué précédemment.
À la fin de l’incubation, placez les échantillons dans des tubes et lavez-les trois fois avec du PBS pendant deux heures tout en agitant. Ajoutez ensuite une solution d’inactivation aux échantillons et incubez pendant la nuit dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Après avoir effectué trois lavages, ajoutez une solution de nettoyage aux échantillons et incubez dans un bain-marie à 55 degrés Celsius pendant trois à sept jours.
À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec du PBST à 37 degrés Celsius pendant trois heures dans un incubateur. Le lendemain, ajoutez 10 millilitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % à chaque échantillon et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 10 minutes tout en agitant à température ambiante. Ensuite, préchauffez la solution de récupération d’antigène à 95 degrés Celsius dans un bain-marie.
Transférez les échantillons dans la solution chauffée et incubez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis 40 minutes à température ambiante sur un agitateur. Lavez les échantillons avec de l’eau déminéralisée pendant cinq minutes tout en agitant. Équilibrez les échantillons dans PBS.
Transférez maintenant les échantillons dans des plats avec des couvercles à vis. Après avoir préparé une solution d’anticorps primaire fraîche pour tous les échantillons dans un bécher, ajoutez-la aux échantillons et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant un à sept jours en agitant doucement dans l’obscurité. Placez ensuite les échantillons dans des tubes et lavez-les à l’aide de PBST préchauffé à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.
Déplacez les échantillons dans des boîtes avec des couvercles à vis et ajoutez des anticorps secondaires préparés dans du PBST et de l’azoture de sodium à 0,01 %. Transférez les échantillons dans des tubes et lavez-les avec du PBST préchauffé trois fois à 37 degrés Celsius pendant deux heures tout en agitant. Pour l’appariement de l’indice de réfraction, placez les échantillons dans de nouvelles boîtes et ajoutez 30% de solution de TDE.
Remplacez ensuite 30 % de TDE par une solution de 68 % de TDE dans les échantillons et laissez-les à température ambiante tout en agitant. Après le traitement court, une transparence optimale et homogène de toutes les tranches de tissu a été obtenue dans la matière grise et blanche.
