Dissoziation von Epithelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen und Bestimmung des optimalen Kryokonservierungsstadiums

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03:06 min

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200823-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen

Transkript

Verdünnen Sie zunächst ein Fläschchen mit aufgetauter kalter Basalmembranmatrix mit 12 Millilitern DM EM F12. Mischen Sie die Suspension gut. Geben Sie einen Deckschlader in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.

Pipettieren Sie dann 250 Mikroliter der verdünnten Matrixlösung in jede Vertiefung. Entsorgen Sie das Kulturmedium der kultivierten hESC-abgeleiteten retinalen Pigmentepithelzellplatten. Waschen Sie die Teller zweimal mit einem Milliliter vorgewärmtem PBS pro Mulde.

Geben Sie als Nächstes 0,5 Milliliter des Zelldissoziationsreagenzes in die Vertiefungen der Kulturplatten und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Verdauung einzuleiten. Beobachten Sie die Zellen nach der Inkubation unter dem Mikroskop, um das Ende der Verdauung zu bestätigen. Pipettieren Sie nun mit einer Ein-Milliliter-Pipette die Zellsuspension vorsichtig 10 Mal auf und ab.

Fügen Sie vorgewärmtes Kulturmedium hinzu, um die Suspension zu verdünnen. Dann zentrifugieren Sie es bei 250 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen aus.

Suspendieren Sie dann das Zellpellet wieder in zwei Millilitern des Kulturmediums. Mischen Sie die Zellen mit einer Pipette 10 bis 15 Mal. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb.

Zählen Sie als nächstes die retinalen Pigmentepithelzellen. Saugen Sie die Beschichtungslösung vor dem Plattieren an. Geben Sie dann einen Milliliter des Kulturmediums in jede Vertiefung und säen Sie die Zellen auf den Deckgläsern aus.

Nehmen Sie nach der EDU-Inkorporation und Färbung die Bilder von fünf zufälligen Feldern mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Berechnen Sie den Prozentsatz der EDU-positiven Zellen. Zeichnen Sie dann die entsprechenden Anteilszeitkurven, um eine Wachstumskurve zu erstellen.

Bestimmen Sie abschließend das Gefrierfenster aus der Exponentialphase für jede Zelllinie. Die retinalen Pigmentepithelzellen verloren zunächst ihre charakteristische hexagonale Morphologie, erlangten diese aber später in der exponentiellen Wachstumsphase zurück. Wenn die Zellen eine weitere Woche lang kultiviert wurden, nahm die Zellproliferation ab.

Der EDU-Proliferationsassay bestätigte, dass P2-Zellen am fünften Tag eine höhere Proliferationsrate aufwiesen, während P2-Zellen am fünften Tag in die Verzögerungsphase eingetreten waren.

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