Dissociação de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas e determinação ideal do estágio de criopreservação

Para começar, dilua um frasco de matriz de membrana basal fria descongelada com 12 mililitros de DM EM F12. Misture bem a suspensão. Adicione uma lamínula em cada poço de uma placa de 24 poços.

Em seguida, pipete 250 microlitros da solução de matriz diluída em cada poço. Descarte o meio de cultura das placas de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de hESC cultivadas. Lave as placas duas vezes com um mililitro de PBS pré-aquecido por poço.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros do reagente de dissociação celular aos poços das placas de cultura e incube-os a 37 graus Celsius por 15 minutos para iniciar a digestão. Após a incubação, observe as células ao microscópio para confirmar o fim da digestão. Agora, com uma pipeta de um mililitro, pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo 10 vezes.

Adicione meio de cultura pré-aquecido para diluir a suspensão. Em seguida, centrifugue a 250 G por três minutos em temperatura ambiente. Despeje o sobrenadante do tubo de centrífuga.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros do meio de cultura. Use uma pipeta para misturar as células 10 a 15 vezes. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 micrómetros.

Em seguida, conte as células epiteliais pigmentares da retina. Aspire a solução de revestimento antes de banhar. Em seguida, adicione um mililitro do meio de cultura em cada poço e semeie as células nas lamínulas.

Após a incorporação e coloração do EDU, capture as imagens de cinco campos aleatórios com um microscópio de fluorescência. Calcule a porcentagem de células positivas para EDU. Em seguida, plote as curvas de tempo de proporção correspondentes para gerar uma curva de crescimento.

Por fim, determine a janela de congelamento da fase exponencial para cada linha celular. As células epiteliais pigmentares da retina inicialmente perderam sua morfologia hexagonal característica, mas depois a recuperaram na fase exponencial de crescimento. Quando as células foram cultivadas por mais uma semana, a proliferação celular diminuiu.

O ensaio de proliferação de EDU confirmou que as células P2 dia cinco exibiram uma taxa de proliferação mais alta, enquanto as células P2 dia 11 entraram na fase de desaceleração.