최적화된 냉동 보존을 통한 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 보존

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다

필기록

먼저 hESC 유래 망막 색소 상피 세포를 해리하고 세포 현탁액을 준비한 다음 세포를 셉니다. 이제 250g에서 실온에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 붓고 세포 펠릿을 동결 보존 배지에 재현탁시킵니다.

다음으로, 세포 현탁액 1mL를 1.2mL 극저온 바이알에 옮깁니다. 극저온 바이알을 냉동 용기에 넣고 섭씨 영하 80도에서 밤새 얼립니다. 장기 보관을 위해 바이알을 액체 질소로 옮깁니다.

냉동 바이알을 해동하려면 먼저 섭씨 37도로 가열된 금속 비드의 배양 배지를 가열하고 데워진 배양 배지 10ml를 15밀리리터 튜브에 미리 채웁니다. 이제 액체 질소에서 극저온 바이알을 제거하고 빠른 해동을 위해 자동 해동 시스템에 넣습니다. 0.5-1밀리리터의 예열된 배양 배지를 극저온 바이알에 떨어뜨려 점진적인 세포 적응을 보장합니다.

그런 다음, 세포 현탁액 1.5 내지 2 밀리리터를 배지로 15 밀리리터 튜브에 피펫합니다. 250g에서 실온에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 버립니다.

펠릿을 2밀리리터의 따뜻한 매체에 재현탁시킵니다. 혈구측정기에 세포를 로드하고 세포를 세어 회수율과 생존율을 결정합니다. 기저막 코팅 플레이트의 해동된 세포를 Y27632로 배양 배지에서 배양합니다.

기하급수적 단계에서 5일째에 동결된 망막 색소 상피세포는 해동 후 더 높은 부착률을 보였다. 그들의 특징적인 육각형 형태에 비해, 다른 시점에서 동결된 세포는 섬유아세포 표현형을 가졌습니다. P2 5일째 세포는 해동 28일 후에 더 높은 발현과 더 적절하게 국소화된 세포 마커를 나타냈습니다.

서로 다른 동결 보존 배지가 해동 후 높은 세포 생존율과 부착을 달성하는 데 동등하게 잘 수행된다는 점에 주목했습니다.

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