Per iniziare, pipettare 3,75 millilitri di terreno sierico ridotto in una provetta marcata A e diluire il terreno con 105 microlitri del reagente di trasfezione. Agitare il contenuto del tubo per mescolare bene. Successivamente, aggiungere 3,75 millilitri del terreno sierico ridotto in una provetta etichettata B.Diluire i plasmidi di espressione con 90 microlitri di reagente potenziatore.
Ora aggiungere il contenuto della provetta A alla provetta B e pipettare la soluzione per miscelarla bene prima dell'incubazione. Rimuovere con cautela 10 millilitri di terreno di coltura cellulare da una piastra ecologica Phoenix preparata. Quindi aggiungere l'intero volume della miscela di trasfezione sulla piastra goccia a goccia.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'incubatrice. Mettere il terreno di raccolta virale MTCM a bagnomaria a 37 gradi Celsius per preriscaldarlo. A questo punto, inclinare la piastra Phoenix eco ed estrarre la pipetta dal terreno di coltura.
Successivamente, pipettare lentamente 30 millilitri del terreno di raccolta virale preriscaldato nella piastra inclinata. Rimetti le cellule nell'incubatrice. Dopo 48 ore di trasfezione, prelevare il surnatante virale.
Filtrare attraverso filtri PVDF da 0,45 micrometri. Con il retro di una siringa sterile, schiacciare le milze murine isolate attraverso un colino cellulare da 70 a 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi lavare il filtro con cinque millilitri di tampone di isolamento delle cellule T.
Dopo aver portato il volume finale delle cellule a 50 millilitri, contare le cellule con l'emocitometro. Pellettare le cellule mediante centrifugazione per 10 minuti a 450 G a quattro gradi Celsius o a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare contenente gli splenociti con il kit di isolamento delle cellule T raccomandato.
Quindi isolare i linfociti T CD3 positivi utilizzando la selezione negativa. Trasferire l'isolato separato magneticamente in una provetta conica da 15 millilitri. Controllare di nuovo il conteggio delle celle.
Centrifugare le cellule T isolate per 10 minuti a 450 G a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere il pellet cellulare nel mezzo di attivazione MTCM. Ora aggiungi le perle magnetiche rivestite di anticorpi e l'interleuchina-2 alla sospensione cellulare per attivare le cellule T.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per una notte. Il giorno zero, pre-rivestire piastre sterili a 24 pozzetti non trattate con 0,5 millilitri di reagente per il potenziamento della trasduzione della fibronectina umana. Conservare le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, rimuovere il reagente di trasduzione dai pozzetti. Bloccare i pozzetti con un uguale volume di PBS sterile filtrato integrato con BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il PBS BSA e lavare i pozzetti con PBS da 0,5 a un millilitro.
Successivamente, aggiungere un millilitro di retrovirus puro a ciascun pozzetto pre-rivestito. Centrifugare la piastra a 2.000 g per 90 minuti a 32 gradi Celsius. Quindi aggiungere un millilitro delle cellule T attivate a ciascun pozzetto caricato viralmente.
Centrifugare nuovamente le piastre a 450 g per 10 minuti a 32 gradi Celsius. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una notte. Il quinto giorno, risospendere le cellule per dissociare le cellule T attivate dalle perle rivestite di anticorpi.
Posizionare la sospensione cellulare su un magnete per 30 secondi. Quindi trasferire la sospensione in un recipiente di coltura ex vivo. Posizionare i vasi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius prima dell'analisi citofluorimetrica.
L'uso del kit di isolamento delle cellule T ha prodotto una purezza delle cellule T inferiore al 98% prima della trasduzione. Sono stati raggiunti tassi di espressione CAR riproducibili dal 65 al 75%. Le colture ex vivo con interleuchine-7 e 15 hanno portato a una post-attivazione di 15 volte entro il giorno 10 da una singola milza.
La coltura delle cellule T con le interleuchine ha portato a frequenze comparabili delle cellule T CD8 positive e CD4 positive. Dopo 10 giorni di coltura ex vivo, è stato osservato che le popolazioni di memoria delle cellule staminali erano conservate.
