Name: Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-11-17T13:10:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions at JoVE.com

collection, embedding, sectioning, and staining of the mouse submandibular salivary gland for live cell imaging of cell-cell interactions

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions at JoVE.com

Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions (Video) | JoVE 

Сбор, внедрение, секционирование и окрашивание подчелюстной слюнной железы мыши для визуализации межклеточных взаимодействий в живых клетках

Для начала используйте щипцы, чтобы удалить жир и соединительную ткань из рассеченной подчелюстной слюнной железы мыши, подвергшейся эвтаназии. Затем поместите железу в сборную пробирку с ледяным раствором HBSS. Далее с помощью щипцов разрежьте железу на квадратные кусочки по одному сантиметру.Нагрейте 4%-ную агарозу до 50 градусов Цельсия, и перелейте раствор в 35-миллиметровую посуду. Налейте небольшое количество раствора агарозы в отдельную посуду и добавьте в нее кусочки железы. Затем вмешайте кусочки в избытке агарозы, чтобы покрыть его.Далее поместите четыре-шесть кусочков железы плашмя в первую посуду с агарозой. Накройте блюдо крышкой и переложите его в ящик для льда, накрыв тарелку льдом, чтобы она остыла и застыла. Чтобы разделить кусочки железы, сначала с помощью скальпеля аккуратно разрежьте вокруг сальника встроенный агарозный блок.Далее наносим каплю суперклея на агарозный блок и прикрепляем его к сцене вибратома. Теперь заполните вибратомную камеру ледяным PBS, содержащим 1% пенициллина стрептомицина. Скальпелем обрежьте излишки агарозы и создайте пятимиллиметровые промежутки между каждым кусочком железы.Совместите лопатку вибратома с агарозным блоком и установите начальную и конечную точки секций. Разрежьте блок ткани на секции толщиной 150 микрометров с низкой скоростью и высокой вибрацией. После того, как срезы будут нарезаны, используйте кисть, чтобы собрать ломтики и поместить их в посуду с предварительно подогретой средой RPMI, содержащей антибиотики.Чтобы культивировать подчелюстные срезы, сначала добавьте 1,5 миллилитра среды RPMI в лунки шестилуночного планшета. Поместите в лунки фильтры размером 0,4 микрометра. Далее с помощью кисти аккуратно перенесите от одного до шести ломтиков на каждый фильтр.Затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа. Облучив несколько экспериментальных планшетов гамма-излучением, чтобы вызвать травму, верните пластины в инкубатор. Далее лунки 24-луночного планшета заполняют 500 микролитрами питательной среды.Кистью поднимите срезы из фильтра и аккуратно погрузите их в лунки. Инкубируйте срезы в соответствующих ядерных пятнах. Затем инкубируйте срезы с антителами в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия при легком перемешивании.Погрузите срезы в питательную среду три раза, чтобы промыть их. Дайте ломтикам инкубироваться в каждом промывочном растворе в течение 10 минут при комнатной температуре при легком перемешивании. Затем с помощью щипцов снимите ленту с двустороннего спейсера.Приклейте спейсер к нижней части шестилуночной пластины со стеклянным дном, затем пипеткой налейте 50 микролитров среды в зазор в центре спейсера. Поместите ломтик в носитель, убедившись, что он лежит ровно. Затем пипеткой аккуратно извлеките 20 микролитров среды из зазора.С помощью щипцов осторожно снимите ленту с верхней стороны прокладки и наденьте на нее 25-миллиметровую круглую крышку. Надавите на края распорки, чтобы обеспечить надежное крепление накладки. Изображение среза на конфокальном микроскопе.Необлученные срезы подчелюстной железы, культивируемые в течение семи дней, сохраняли свой сигнал МТ и эпителиальную архитектуру. Однако через трое суток после облучения наблюдалась ацинарная и протоковая атрофия клеток. Каспаз-положительные клетки были обнаружены через четыре дня после облучения.Повышенный гамма-H2AX наблюдался в облученных срезах, что свидетельствует о повреждении ДНК in vivo. Визуализация макрофагов в реальном времени подтвердила фагоцитоз эпителиальных клеток в модели культуры среза. Отдельные клетки могут быть обнаружены и сегментированы для последующего анализа поведения клеток, например, миграции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions

Real-Time Live Imaging of Mouse Submandibular Gland Regeneration

Studying Macrophage-Epithelial Cell Interactions in Salivary Gland Regeneration After Injury (Video) | JoVE

Исследование межклеточных взаимодействий в слюнных железах с помощью визуализации живых клеток ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...