CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

首先，通过离心收获药物处理的PBMC，并将细胞裂解物收集在PCR板中。离心板以收集底部的裂解物。接下来，使用热循环仪进行mRNA变性。

然后向每个孔中加入 6 微升逆转录酶反应混合物，使总体积达到 12 微升。密封板以防止污染并防止蒸发。短暂涡旋后离心板。

将板放在热循环仪上并启动逆转录反应程序。逆转录后，离心PCR板，向每个孔中加入15μL预扩增混合物并密封。将密封板放在热循环仪上并开始预扩增反应。

要净化cDNA，请向每个孔中加入磁性纯化珠，并在室温下孵育5分钟。将PCR板放在磁性架上五分钟或直到珠子分离。之后，小心地除去上清液。

在将板保持在磁架上的同时，轻轻引入 100 微升新鲜制备的 80% 乙醇以清洁珠子。孵育30秒后，使用移液管除去上清液。让珠子在磁架上风干五分钟，或直到乙醇完全蒸发并且珠子不再有光泽。

从磁架上取下板后，将珠子重新悬浮在 20 微升无核酸酶水中。将板重新定位在磁性架上，直到珠子分离。将洗脱液转移到准备用于cDNA质量控制和标记的新鲜PCR板中。

对于标记，将每个反应的 3 μL 标记混合物添加到新的 PCR 板上。在每次反应中加入一微升 cDNA。立即开始标记反应。

然后通过向每个反应中加入一微升中和标记缓冲液来中和反应。对于富集PCR，在每个反应中加入9微升富集PCR混合物，使总体积达到14微升。启动富集PCR程序。