Name: CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-02-23T13:30:00
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cdna library preparation from the drug treated-peripheral blood mononuclear cell (pbmc) lysate for mrna sequencing

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

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CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing (Video) | JoVE 

mRNA अनुक्रमण के लिए ड्रग ट्रीटेड-पेरिफेरल ब्लड मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMC) लाइसेट से cDNA लाइब्रेरी की तैयारी

शुरू करने के लिए, दवा इलाज PBMCs centrifugation द्वारा फसल और एक पीसीआर प्लेट में सेल lysate इकट्ठा. तल पर लाइसेट इकट्ठा करने के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें। अगला, थर्मोसाइक्लर का उपयोग करके एमआरएनए विकृतीकरण करें।फिर 12 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया मिश्रण के छह माइक्रोलीटर जोड़ें। संदूषण से बचाने और वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट को सील करें। संक्षेप में भंवर करने के बाद प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।थर्मोसाइक्लर पर प्लेट की स्थिति और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया कार्यक्रम शुरू करें। रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, पीसीआर प्लेट अपकेंद्रित्र, प्रत्येक अच्छी तरह से में पूर्व प्रवर्धन मिश्रण के 15 microliters जोड़ने और यह सील. थर्मोसाइक्लर पर सीलबंद प्लेट रखें और पूर्व-प्रवर्धन प्रतिक्रिया शुरू करें।सीडीएनए को साफ करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से चुंबकीय शुद्धि मोती जोड़ें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए सेते हैं. पीसीआर प्लेट को चुंबकीय रैक पर पांच मिनट के लिए या मोतियों के अलग होने तक रखें। उसके बाद, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।जबकि चुंबकीय रैक पर थाली को बनाए रखने, धीरे मोती साफ करने के लिए ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 100 microliters परिचय. एक 30 सेकंड इनक्यूबेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को खत्म करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें. मोतियों को पांच मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर हवा में सूखने दें या जब तक कि इथेनॉल पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए और मोती अब चमकदार न दिखाई दें।चुंबकीय रैक से प्लेट को हटाने के बाद, न्यूक्लीज मुक्त पानी के 20 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें। मोतियों अलग कर रहे हैं जब तक चुंबकीय रैक पर थाली reposition. सीडीएनए गुणवत्ता नियंत्रण और टैगमेंटेशन के लिए तैयार एक ताजा पीसीआर प्लेट में एल्यूट को स्थानांतरित करें।टैगमेंटेशन के लिए, एक नई पीसीआर प्लेट पर प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए टैगमेंटेशन मिश्रण के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक प्रतिक्रिया में सीडीएनए का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया तुरंत शुरू करें।फिर प्रत्येक प्रतिक्रिया में तटस्थ टैगमेंट बफर के एक माइक्रोलीटर को जोड़कर प्रतिक्रिया को बेअसर करें। संवर्धन पीसीआर के लिए, 14 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में संवर्धन पीसीआर मिश्रण के नौ माइक्रोलीटर जोड़ें। संवर्धन पीसीआर प्रोग्राम प्रारंभ करें।

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