Mouse Ocular Lens Equatorial Region Whole Mount Preparation and Confocal Imaging to Understand the Lens Structural-Developmental Relationship

Comience toda la preparación de la montura de la lente fija creando cuñas de agarosa de inmovilización. Para hacerlo, tome un plato con fondo de vidrio y vierta alrededor de cinco a seis mililitros de agarosa fundida al 2%, en PBS, en él. Espere hasta que la agarosa se solidifique.

Luego, use una cuchilla afilada para crear una hendidura triangular en la agarosa solidificada. Retire la rodaja de agarosa y agregue un mililitro de PBS al plato. Aspire cualquier residuo de agarosa que quede después del corte.

Cree varias cuñas en un solo plato para adaptarse a varias lentes, si es necesario. Para almacenar el molde, agregue un mililitro de PBS antes de mantenerlo a cuatro grados centígrados. Con unas pinzas curvas, coloque la lente en la cuña de agarosa que contiene un mililitro de PBS.

Ajuste la lente de modo que la región ecuatorial mire hacia abajo sobre el cristal del microscopio cuando se coloque por encima del objetivo confocal. Coloque el plato en la platina del microscopio. Para confirmar que la región ecuatorial está enfocada, visualice los núcleos, asegurándose de que estén alineados en filas.

Además, verifique las células epiteliales ecuatoriales empaquetadas y formadas irregularmente, y las células de la fila meridional alineadas con precisión y de forma hexagonal, indicadas por la tinción de actina F en las membranas celulares. Un empaquetamiento aleatorio de los núcleos en el campo de visión indica que la lente está orientada hacia el objetivo. Si no se pueden observar núcleos, es probable que indique que el lado posterior del cristalino está orientado hacia el objetivo.

En tales casos, use pinzas curvas para girar la lente hasta que se observen los núcleos alineados con precisión en el ecuador de la lente.