Name: 인슐린 생산 췌장 세포로의 체외 인간 만능 줄기세포 분화
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
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in vitro human pluripotent stem cell differentiation into insulin-producing pancreatic cells

인간 만능줄기세포를 췌장 β세포로 분화시키기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

저자 스포트라이트: 만능줄기세포와의 β세포 분화의 발전과 과제

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

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인슐린 생산 췌장 세포로의 체외 인간 만능 줄기세포 분화

세포 통과 전. 6웰 플레이트에 콜드 코팅 용액을 코팅하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 1시간 동안 배양하고 인간 만능 줄기 세포가 들어 있는 6웰 플레이트에서 줄기 세포 배지를 흡인하고 각 웰에 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS 1밀리리터를 추가합니다. 두 번째 세척 후 500 마이크로 리터의 해리 용액을 각 웰에 넣고 실온에서 2-5 분 동안 배양합니다.그 동안 6웰 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하고 각 웰에 1밀리리터의 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS를 추가합니다. 도립 현미경으로 세포 해리 과정을 관찰합니다. 세포의 80-90%가 둥글고 부착된 것처럼 보이면 6웰 플레이트의 웰에서 해리 용액을 흡인합니다.그런 다음 10 마이크로몰 암석 억제제를 함유한 줄기 세포 배지 1mL를 6웰 플레이트에 추가합니다. 10 마이크로리터의 해리된 세포 현탁액을 튜브에 추가합니다. 그런 다음 같은 양의 트리판 블루를 추가합니다.부드럽게 섞고 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포 계수 후, 0.8 내지 1 x 10을 밀리리터당 6번째 세포에 함유하는 웰당 2 밀리리터의 줄기 세포 배지와 10 마이크로몰 암석 억제제를 첨가한다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 세 번 움직입니다.접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 10회 움직인 후 2시간 동안 배양합니다. 0일과 4일 동안 기초 배지를 모두 해동하고 보충제를 얼음 위에서 해동합니다.매일 섭씨 37도의 수조에서 2ml, 중간 크기 1개, 중간 크기 1개를 5분 동안 데우십시오. 다음으로, 6웰 플레이트의 웰에서 줄기세포 배지를 흡인하고 세척 배지 1 2밀리리터를 추가합니다. 세척 매체 1을 흡인 한 후 즉시 1 일 매체 2 밀리리터를 우물 옆에 추가하십시오.섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 분화 공정의 12일째에 400마이크로미터 마이크로웰이 들어 있는 6웰 플레이트를 2밀리리터의 접착 방지 헹굼 용액으로 처리합니다. 도립 현미경으로 플레이트에 기포가 있는지 관찰합니다.기포가 관찰되지 않으면 접착 방지 헹굼 용액을 흡입하고 즉시 세척 배지 2 2 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 췌장 전구 배지를 흡인하고 웰당 0.5mL의 해리 완충액을 추가합니다. 세포를 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.대부분의 세포가 둥글고 여전히 부착되어 있으면 해리 완충액을 흡입하고 즉시 각 웰에 1밀리리터의 따뜻한 클러스터 배지를 추가합니다. P1000 피펫 팁을 사용하여 원을 번갈아 가며 웰의 상단에서 하단으로 이동하면서 위아래로 피펫팅하면서 세포를 부드럽게 해리하여 웰 전체에서 세포를 고르게 분리합니다. 해리된 세포 혼합물을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.클러스터 배지 1밀리리터를 6웰 플레이트에 추가하여 나머지 세포를 모두 수집합니다. 다음으로, 마이크로웰 6웰 플레이트로부터 세척 배지 2를 흡인하고 해리된 셀 현탁액을 첨가한다. 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.다음 날, P1000 피펫 팁을 사용하여 마이크로웰 6웰 플레이트에서 클러스터를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 천천히 수집합니다. 13일째 배지 1밀리리터를 첨가하여 나머지 클러스터를 수집하고 클러스터를 튜브로 옮깁니다. 세포가 중력에 의해 튜브 바닥에 자연적으로 5분 동안 고정되도록 합니다.세포 클러스터를 방해하지 않고 튜브에서 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 13일째 배지 2mL를 튜브에 넣습니다. 클러스터의 흡인을 피하면서 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.서스펜션을 접착력이 매우 낮은 6웰 플레이트로 옮깁니다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 6회 움직입니다. 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.클러스터의 면역형광 이미지는 췌장 베타 세포 마커를 함께 발현하는 인슐린 생산 세포의 우세를 보여주었습니다. 베타세포 시그니처 유전자의 발현은 약 25%의 세포가 Nkx6.1을 발현하고 40%가 Pdx1을 발현하는 것으로 나타났다. 포도당 자극 인슐린 분비 분석 동안, MEL1 유래 클러스터는 낮은 포도당 농도에 비해 높은 포도당 농도에 반응하여 훨씬 더 높은 수준의 인슐린을 분비했습니다.