Name: In vitro human pluripotent stamcelledifferensiering til insulinproduserende pankreasceller
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Human Pluripotent Stem Cell Differentiation into Insulin-Producing Pancreatic Cells at JoVE.com

in vitro human pluripotent stem cell differentiation into insulin-producing pancreatic cells

Differensiering av humane pluripotente stamceller til β-celler i bukspyttkjertelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

Forfatter Spotlight: Fremskritt og utfordringer i β-cellers differensiering fra pluripotente stamceller

Optimalisert protokoll for generering av funksjonelle insulinutskillende celler i bukspyttkjertelen fra humane pluripotente stamceller

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Human Pluripotent Stem Cell Differentiation into Insulin-Producing Pancreatic Cells at JoVE.com

In vitro human pluripotent stamcelledifferensiering til insulinproduserende pankreasceller

Før cellepassasje. belegg en seks-brønns plate med kald beleggløsning og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time, aspirer stamcellemediet fra seksbrønnsplaten som inneholder humane pluripotente stamceller, og tilsett en milliliter kalsiummagnesiumfri DPBS i hver brønn. Etter den andre vasken, tilsett 500 mikroliter dissosiasjonsoppløsning i hver brønn og inkuber i to til fem minutter ved romtemperatur.I mellomtiden aspirerer du beleggløsningen fra seksbrønnsplaten og tilsett en milliliter kalsiummagnesiumfri DPBS i hver brønn. Under et omvendt mikroskop, observer celledissosiasjonsprosessen. Når 80 til 90% av cellene så ut til å være avrundet og festet, aspirerer dissosiasjonsløsningen fra brønnene på seksbrønnsplaten.Deretter tilsettes en milliliter stamcellemedium som inneholder 10 mikromolar bergartsinhibitor i seksbrønnsplaten. Tilsett 10 mikroliter dissosiert cellesuspensjon i et rør. Deretter legger du til et likt volum trypanblått.Bland forsiktig og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Etter celletelling, tilsett to milliliter stamcellemedium per brønn som inneholder 0, 8 til 1 ganger 10 til 6. celler per milliliter og 10 mikromolar bergarter. Beveg platen raskt frem og tilbake, fra side til side, tre ganger.Plasser platen i en 37 grader Celsius, 5% karbondioksid inkubator. Beveg platen raskt frem og tilbake og fra side til side 10 ganger før du ruger i to timer. Tine både basalmediet i dag null og fire og supplere på is.Varm to milliliter hver dag ett medium og vaskemedium en i et 37 graders vannbad i fem minutter. Deretter aspirerer du stamcellemediet fra brønnene på en seksbrønnplate og tilsett to milliliter vaskemedium en. Etter å ha aspirert vaskemedium en, tilsett umiddelbart to milliliter dag ett medium til siden av brønnen.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 24 timer. På dag 12 av differensieringsprosessen, behandle en seks-brønnplate som inneholder 400 mikrometer mikrobrønner med to milliliter Anti-Adherence Rinsing Solution. Under et omvendt mikroskop, observer platen for bobler.Hvis ingen bobler observeres, aspirer Anti-Adherence Rinsing Solution og tilsett umiddelbart to milliliter vaskemedium to. Deretter aspirerer bukspyttkjertelen stammedium og tilsett 0,5 ml dissosiasjonsbuffer per brønn. Inkuber cellene ved romtemperatur i to til fem minutter.Når de fleste cellene er avrundet og fortsatt er festet, aspirerer dissosiasjonsbufferen og tilsetter umiddelbart en milliliter varmt klyngemedium til hver brønn. Bruk en P1000-pipettespiss til å dissosiere cellene forsiktig, pipettere opp og ned mens du vekselvis bruker en sirkulær bevegelse og beveger deg fra toppen til bunnen av brønnen for å løsne celler jevnt gjennom brønnen. Overfør den dissosierte celleblandingen til et 50 milliliter konisk rør.Legg til en milliliter av klyngemediet i seksbrønnplaten for å samle alle gjenværende celler. Deretter aspirerer du vaskemedium to fra mikrobrønnplaten med seks brønner og tilsetter dissosiert celleoppheng. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 24 timer.Neste dag, ved hjelp av en P1000 pipettespiss, samler du sakte klynger fra mikrobrønnplaten med seks brønner inn i et 50 milliliter konisk rør. Legg til en milliliter dag 13 medium for å samle de resterende klyngene og overføre klyngene inn i røret. La cellene sette seg naturlig under tyngdekraften til bunnen av røret i fem minutter.Aspirer supernatanten forsiktig fra røret uten å forstyrre celleklyngene. Deretter legger du til to milliliter dag 13 medium i røret. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned, unngå aspirasjon av klynger.Overfør suspensjonen til en plate med svært lav adherent seksbrønn. Beveg platen raskt frem og tilbake, fra side til side, seks ganger. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 48 timer.Immunfluorescensbilder av klyngene viste overvekt av insulinproduserende celler som samtidig uttrykker betacellemarkørene i bukspyttkjertelen. Ekspresjonen av betacellesignaturgener avslørte omtrent 25% av cellene som uttrykker Nkx6.1 og 40% som uttrykker Pdx1. Under glukosestimulert insulinsekresjonsanalysen utskilte MEL1-deriverte klynger signifikant høyere nivåer av insulin som respons på høye glukosekonsentrasjoner sammenlignet med lave glukosekonsentrasjoner.