Name: İn Vitro İnsan Pluripotent Kök Hücrenin İnsülin Üreten Pankreas Hücrelerine Farklılaşması
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Human Pluripotent Stem Cell Differentiation into Insulin-Producing Pancreatic Cells at JoVE.com

in vitro human pluripotent stem cell differentiation into insulin-producing pancreatic cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Pankreas β Hücrelerine Farklılaşması

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

Yazar Spotlight: Pluripotent Kök Hücrelerden β Hücrelerinin Farklılaşmasındaki Gelişmeler ve Zorluklar

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Human Pluripotent Stem Cell Differentiation into Insulin-Producing Pancreatic Cells at JoVE.com

İn Vitro İnsan Pluripotent Kök Hücrenin İnsülin Üreten Pankreas Hücrelerine Farklılaşması

Hücre geçişinden önce. altı oyuklu bir plakayı soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin, kök hücre ortamını insan pluripotent kök hücrelerini içeren altı oyuklu plakadan aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre kalsiyum magnezyum içermeyen DPBS ekleyin. İkinci yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre ayrışma çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe edin.Bu arada, kaplama çözeltisini altı oyuklu plakadan aspire edin ve her oyuğa bir mililitre kalsiyum magnezyum içermeyen DPBS ekleyin. Ters çevrilmiş bir mikroskop altında, hücre ayrışma sürecini gözlemleyin. Hücrelerin% 80 ila 90'ı yuvarlak ve yapışkan göründüğünde, ayrışma çözeltisini altı oyuklu plakanın oyuklarından aspire edin.Daha sonra altı oyuklu plakaya 10 mikromolar kaya inhibitörü içeren bir mililitre kök hücre ortamı ekleyin. Bir tüpe 10 mikrolitre ayrışmış hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, eşit hacimde tripan mavisi ekleyin.Yavaşça karıştırın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayımından sonra, 0.8 ila 1 kez 10 ila 6 içeren kuyucuk başına iki mililitre kök hücre ortamı ekleyin.th mililitre başına hücreler ve 10 mikromolar kaya inhibitörü. Plakayı üç kez hızlı bir şekilde ileri geri, yan yana hareket ettirin.Plakayı 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. İki saat inkübe etmeden önce plakayı 10 kez hızlı bir şekilde ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Hem sıfır hem de dördüncü günler için bazal ortamı çözün ve buz üzerinde takviye edin.Her gün iki mililitre, bir orta ve bir yıkama ortamı, biri 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika ısıtın. Daha sonra, kök hücre ortamını altı oyuklu bir plakanın kuyularından aspire edin ve iki mililitre yıkama ortamı ekleyin. Birinci yıkama ortamını aspire ettikten sonra, hemen kuyu kenarına iki mililitre birinci gün ortamı ekleyin.Hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Farklılaşma işleminin 12. gününde, 400 mikrometre mikro kuyu içeren altı oyuklu bir plakaya iki mililitre Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu uygulayın. Ters çevrilmiş bir mikroskop altında, plakada kabarcıklar olup olmadığını gözlemleyin.Kabarcık gözlenmezse, Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonunu aspire edin ve hemen iki mililitre yıkama ortamı ekleyin. Daha sonra, pankreas progenitör ortamını aspire edin ve oyuk başına 0.5 mililitre ayrışma tamponu ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe edin.Hücrelerin çoğu yuvarlatıldığında ve hala yapıştığında, ayrışma tamponunu aspire edin ve hemen her oyuğa bir mililitre sıcak küme ortamı ekleyin. Bir P1000 pipet ucu kullanarak, hücreleri nazikçe ayırın, dönüşümlü olarak dairesel bir hareket kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri kuyu boyunca eşit şekilde ayırmak için kuyunun üstünden altına doğru hareket edin. Ayrışmış hücre karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Kalan tüm hücreleri toplamak için altı oyuklu plakaya bir mililitre küme ortamı ekleyin. Daha sonra, mikrokuyu altı oyuklu plakadan yıkama ortamı ikisini aspire edin ve ayrışmış hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, bir P1000 pipet ucu kullanarak, mikro kuyu altı oyuklu plakadan kümeleri yavaşça 50 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Kalan kümeleri toplamak ve kümeleri tüpe aktarmak için bir mililitre 13. gün ortamı ekleyin. Hücrelerin yerçekimi altında doğal olarak beş dakika boyunca tüpün dibine yerleşmesine izin verin.Hücre kümelerini bozmadan süpernatanı tüpten dikkatlice aspire edin. Ardından, tüpe iki mililitre 13. gün ortamı ekleyin. Kümelerin aspirasyonunu önleyerek yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.Süspansiyonu çok düşük yapışan altı oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı altı kez hızlı bir şekilde ileri geri, yan yana hareket ettirin. Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kümelerin immünofloresan görüntüleri, pankreas beta hücre belirteçlerini birlikte eksprese eden insülin üreten hücrelerin baskınlığını gösterdi. Beta hücre imza genlerinin ekspresyonu, Nkx6.1 eksprese eden hücrelerin yaklaşık% 25'ini ve% 40'ı Pdx1'i eksprese etti. Glikoz ile uyarılan insülin sekresyon testi sırasında, MEL1'den türetilen kümeler, düşük glikoz konsantrasyonlarına kıyasla yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde insülin salgıladı.