Name: 전체 뉴런 미토콘드리아 네트워크 특성화를 위한 이미지 분석
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network at JoVE.com

image analysis for characterizing whole-neuron mitochondria network

신경과학에서 미토콘드리아 네트워크를 분석하기 위한 MATLAB 최적화

Cellular mitochondria sit at the center of all physiological states, and a thorough understanding of their homeostasis (mitostasis) and behavior is paramount to assist in identifying pharmacological treatment for a wide range of illnesses, including cancer and Alzheimer&#39;s disease1,2.
Mitochondria play crucial cellular roles in energy homeostasis, ATP generation, calcium buffering, and ROS regulation, and mitostasis is essential for maintaining protein homeostasis as molecular chaperones are energy-dependent3. These require a constant and dynamic network modulation and adaptation to efficiently meet cellular needs, and mitochondria transport is regulated by different signaling pathways; previous work has described one such pathway, that of retinoic acid receptors (RARs)4,5. Retinoic acid (RA) promotes axonal and neurite outgrowth via RAR activation. In mouse primary cortical neurons, activation of RAR-&#946; encourages mitochondrial growth, speed, and mobility in the neurite6.
Considering the mitochondrial network adaptability and dynamics, the possibility of assessing mitostasis in &#34;real time&#34; is essential not only for investigating energy homeostasis, but also for proteostasis, cellular health, proliferation, or signaling. A commonly used method for evaluating mitostasis relies on confocal microscopy after highlighting mitochondria using a fluorescent dye or marker, as well as a specific microscopy setup allowing temperature and/or CO2 regulation7. This type of experimental setup entails that one experimental replicate be performed at a time. In addition to experimental repetition of different treatments, it should be considered that most experiments should have their technical replicates (where more than one position is imaged per plate), with a series of focal planes (z-stacks) being recorded in a series of time points. Thus, an experimental design with three repetitions of one control and two treatments, with five imaging positions per plate, and 15 time points, results in 225 stacks to be processed. Classically, videos of live mitochondria were analyzed by plotting kymographs, which would be individually analyzed8, in a time-consuming process requiring extensive manual input, even when relying on computer tools.
An algorithm was recently described9 that allows automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell 2-D and 3-D time-lapse files. Other quantification techniques are available, and all have their limitations10. Mitometer, an automated open-source application, is particularly adequate for time lapse and mitochondria dynamics analysis, requiring low user input. This application has a series of advantages over other existing MATLAB-based tools, namely allowing the automatic processing of individual TIF stacks, using up to 13 different parameters, particularly interesting for neurosciences, as it differentiates between peri- and tele-nuclear mitochondria.
However, for an experiment such as the above described, these 13 parameters applied to 225 stacks result in 2,925 individual output files. These require four individual computer inputs, which sum up to over 10,000 manual inputs being required to download all output files. For large experimental designs, this results in a needlessly extremely time-consuming analysis of each file and data integration. Herein we present a routine optimization that allows swift file analysis, greatly reducing document reading and data processing, analyzing data in a defined manner, consistent with the output from existing tools.

저자 스포트라이트: 신경 세포 미토콘드리아의 레티노산 수용체를 조사하기 위한 최적화된 자동화 방법

동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석

My research has focused on the area of neuroscience, and in particular, we want to understand the molecular basis of disease. This has led us to look at cells, their structure, and the organelles that carry out the different cellular functions. Increasingly, mitochondria, they have received more and more attention.Anomalies at the mitochondrial level are becoming absolutely fundamental to understand disease processes, and they may even provide interesting targets for novel drugs or therapeutic strategies. Here at the University of Aveiro, we have been able to develop tools that are of interest to study mitochondria. Not only microscopy and the more traditional approaches, but also we have been able to optimize automated analysis tools coupled with bioinformatic strategies to be able to quantify and provide more detailed analysis when addressing mitochondrial function.The most recent advances include the machine learning algorithms for image segmentation and quantification of mitochondrial parameters. And also the high throughput imaging platforms and deep learning algorithms for improving accuracy and efficiency of mitochondrial characterization. Technologies currently used to advance the field of mitochondrial analysis include high resolution microscopy, live imaging systems, computational analysis tools coupled with machine learning protocols, and CRISPR-Cas9 genome editing for mitochondrial morphology and biology analysis.Current experimental challenges in the field of mitochondria include developing reliable and accurate measurements of mitochondrial parameters, considering the heterogeneity of mitochondrial populations, analyzing the interplay between mitochondrial and cellular biology, and developing non-invasive tools for studying mitochondria in vivo. Our tool enhances efficiency and reliability, allowing for a robust automated analysis of mitochondria. Furthermore, we can explore the potential of hyaluronic acid receptor modulation in personalized medicine for mitochondria.

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전체 뉴런 미토콘드리아 네트워크 특성화를 위한 이미지 분석

먼저 이미지 J2.1.0에서 타임랩스 미토콘드리아 이미지를 엽니다. 시야에 따라 위치 스택을 분리하려면 메뉴 표시줄로 이동하고 Image를 클릭합니다. 그런 다음 [복제], [슬라이스 입력] 또는 [프레임 번호]로 이동하고 [확인]을 클릭합니다. 다음으로 자유 선택 도구를 사용하여 셀 주위에 관심 영역을 그립니다.매크로를 실행하려면 이미지 J를 열고 메뉴 바에서 플러그인, 매크로, 실행을 클릭합니다. 그런 다음 배경 지우기를 선택하고 이미지의 매크로를 저장합니다. 픽셀 크기와 복셀 심도를 확인하려면 영상 J를 열고 영상을 선택하십시오.메뉴 표시줄에 액세스하여 Image(이미지)를 선택하고 Properties(속성)를 클릭합니다. 픽셀 크기와 복셀 심도를 결정한 후 자유 선택 도구를 사용하여 전체 셀을 포함하는 관심 영역을 그려 15개 프레임 전체에 전체 셀을 포함합니다. 메뉴 바(Menu bar) 로 이동하여 플러그인(Plugins), 매크로(Macros) 를 클릭하고 배경 지우기(Clear the Background) 를 선택하고 이미지의 매크로(MACRO) 를 저장합니다.원하는 저장 폴더를 선택하고 저장을 클릭하여 파일을 TIFF 형식으로 저장합니다. 그런 다음 All Tracks(모든 트랙), Perinuclear Tracks(핵 주변 트랙) 및 Telenuclear Tracks(원격 핵 트랙)라는 세 개의 기본 폴더를 만듭니다. 각 기본 폴더 내에서 처리할 각 이미지에 대해 번호가 매겨진 하위 폴더를 1부터 시작합니다.두 루틴 최적화 보충 파일의 사본을 각 이미지 폴더에 추가하십시오. 기본 mat 파일 버전을 식별하거나 변경하려면 환경 섹션의 홈 탭으로 이동하여 기본 설정을 클릭합니다. 그런 다음 MATLAB을 선택합니다.컴퓨터에서 MATLAB을 열고 메뉴 표시줄로 이동한 다음 앱을 선택하고 Mitometer를 엽니다. 3D 시작을 선택하고 픽셀 크기를 0.1395089마이크로미터로, 프레임 사이의 시간을 15초로, Z 평면 수를 8로, Z 평면 사이의 축 거리를 0.418809마이크로미터로 설정합니다. 입력할 이미지를 선택합니다.이제 Mitometer 사이드 메뉴로 이동하여 Image를 선택하고 Select Highlighted를 클릭합니다. Mitometer 메뉴 모음으로 이동하여 Select Tracks(트랙 선택)를 선택한 다음 Track Views(트랙 뷰)를 선택합니다. 그런 다음 모든 트랙, Telenuclear 또는 Perinuclear 옵션 중에서 선택합니다.txt에 저장을 선택하여 결과를 텍스트 파일에 저장하고, 생성된 폴더에 결과 파일의 압축을 풉니다. 이미지 인코딩을 위한 키가 포함된 무작위화 xlsx 파일을 준비합니다. 1부터 시작하는 연속된 정수 시퀀스를 열 A에 삽입하고 열 B를 분석 변수를 구성하는 영숫자로 채웁니다.실행 파일 mlx를 두 번 클릭하고, 폴더 수를 입력하고, 폴더의 디렉터리 지정을 클릭하고, 디렉터리 저장을 선택합니다. 출력 파일에서 스프레드시트 이름을 선택하고 실행을 클릭합니다. 그런 다음 필요한 통계 분석을 수행합니다.치료 후 미토콘드리아의 대표 이미지, 각 표면 플롯 및 자동 분할이 제시됩니다. AM580으로 처리된 세포에서 평균 미토콘드리아 길이의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 미토콘드리아 표면적은 AM580 및 BMS493으로 처리된 세포에서 현저히 감소했습니다.미토콘드리아 부피에 대해 정규화된 TMRM 강도는 레티노산과 CH55로 처리된 세포에서 현저한 감소를 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...