Name: Tüm Nöron Mitokondri Ağını Karakterize Etmek için Görüntü Analizi
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network at JoVE.com

image analysis for characterizing whole-neuron mitochondria network

Sinirbilimde Mitokondriyal Ağları Analiz Etmek için MATLAB Optimizasyonu

Cellular mitochondria sit at the center of all physiological states, and a thorough understanding of their homeostasis (mitostasis) and behavior is paramount to assist in identifying pharmacological treatment for a wide range of illnesses, including cancer and Alzheimer&#39;s disease1,2.
Mitochondria play crucial cellular roles in energy homeostasis, ATP generation, calcium buffering, and ROS regulation, and mitostasis is essential for maintaining protein homeostasis as molecular chaperones are energy-dependent3. These require a constant and dynamic network modulation and adaptation to efficiently meet cellular needs, and mitochondria transport is regulated by different signaling pathways; previous work has described one such pathway, that of retinoic acid receptors (RARs)4,5. Retinoic acid (RA) promotes axonal and neurite outgrowth via RAR activation. In mouse primary cortical neurons, activation of RAR-&#946; encourages mitochondrial growth, speed, and mobility in the neurite6.
Considering the mitochondrial network adaptability and dynamics, the possibility of assessing mitostasis in &#34;real time&#34; is essential not only for investigating energy homeostasis, but also for proteostasis, cellular health, proliferation, or signaling. A commonly used method for evaluating mitostasis relies on confocal microscopy after highlighting mitochondria using a fluorescent dye or marker, as well as a specific microscopy setup allowing temperature and/or CO2 regulation7. This type of experimental setup entails that one experimental replicate be performed at a time. In addition to experimental repetition of different treatments, it should be considered that most experiments should have their technical replicates (where more than one position is imaged per plate), with a series of focal planes (z-stacks) being recorded in a series of time points. Thus, an experimental design with three repetitions of one control and two treatments, with five imaging positions per plate, and 15 time points, results in 225 stacks to be processed. Classically, videos of live mitochondria were analyzed by plotting kymographs, which would be individually analyzed8, in a time-consuming process requiring extensive manual input, even when relying on computer tools.
An algorithm was recently described9 that allows automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell 2-D and 3-D time-lapse files. Other quantification techniques are available, and all have their limitations10. Mitometer, an automated open-source application, is particularly adequate for time lapse and mitochondria dynamics analysis, requiring low user input. This application has a series of advantages over other existing MATLAB-based tools, namely allowing the automatic processing of individual TIF stacks, using up to 13 different parameters, particularly interesting for neurosciences, as it differentiates between peri- and tele-nuclear mitochondria.
However, for an experiment such as the above described, these 13 parameters applied to 225 stacks result in 2,925 individual output files. These require four individual computer inputs, which sum up to over 10,000 manual inputs being required to download all output files. For large experimental designs, this results in a needlessly extremely time-consuming analysis of each file and data integration. Herein we present a routine optimization that allows swift file analysis, greatly reducing document reading and data processing, analyzing data in a defined manner, consistent with the output from existing tools.

Yazar Spotlight: Nöronal Mitokondride Retinoik Asit Reseptörlerini Araştırmak İçin Optimize Edilmiş Otomatik Bir Yöntem

İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi

My research has focused on the area of neuroscience, and in particular, we want to understand the molecular basis of disease. This has led us to look at cells, their structure, and the organelles that carry out the different cellular functions. Increasingly, mitochondria, they have received more and more attention.Anomalies at the mitochondrial level are becoming absolutely fundamental to understand disease processes, and they may even provide interesting targets for novel drugs or therapeutic strategies. Here at the University of Aveiro, we have been able to develop tools that are of interest to study mitochondria. Not only microscopy and the more traditional approaches, but also we have been able to optimize automated analysis tools coupled with bioinformatic strategies to be able to quantify and provide more detailed analysis when addressing mitochondrial function.The most recent advances include the machine learning algorithms for image segmentation and quantification of mitochondrial parameters. And also the high throughput imaging platforms and deep learning algorithms for improving accuracy and efficiency of mitochondrial characterization. Technologies currently used to advance the field of mitochondrial analysis include high resolution microscopy, live imaging systems, computational analysis tools coupled with machine learning protocols, and CRISPR-Cas9 genome editing for mitochondrial morphology and biology analysis.Current experimental challenges in the field of mitochondria include developing reliable and accurate measurements of mitochondrial parameters, considering the heterogeneity of mitochondrial populations, analyzing the interplay between mitochondrial and cellular biology, and developing non-invasive tools for studying mitochondria in vivo. Our tool enhances efficiency and reliability, allowing for a robust automated analysis of mitochondria. Furthermore, we can explore the potential of hyaluronic acid receptor modulation in personalized medicine for mitochondria.

Watch this Scientific Journal Video about Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network at JoVE.com

Tüm Nöron Mitokondri Ağını Karakterize Etmek için Görüntü Analizi

Resim J2.1.0'daki hızlandırılmış mitokondriyal görüntüleri açarak başlayın. Menü çubuğuna gidip Görüntü'ye tıklayarak konum yığınlarını görsel alana göre ayırın. Ardından, Çoğalt, Dilim veya Çerçeve Numarası Girin'e gidin ve Tamam'ı tıklayın. Ardından, Serbest Seçim Aracını kullanarak hücrenin etrafına ilgi çekici bir bölge çizin.Makroyu çalıştırmak için Image J'yi açın, Menü çubuğuna gidin ve Eklentiler, Makrolar ve Çalıştır'a tıklayın. Ardından, Arka Planı Temizle'yi seçin ve görüntünün MAKRO'sunu kaydedin. Piksel boyutunu ve voksel derinliğini belirlemek için Image J'yi açın ve Image (Görüntü) öğesini seçin.Menü çubuğuna erişin, Görüntü'yü seçin ve Özellikler'e tıklayın. Piksel boyutunu ve voksel derinliğini belirledikten sonra, tüm hücreyi 15 karenin tümüne dahil etmek için Serbest Seçim Aracını kullanarak tüm hücreyi kapsayan bir ilgi alanı çizin. Menü çubuğuna gidin, Eklentiler, Makrolar'a tıklayın ve Arka Planı Temizle'yi seçin ve görüntünün MAKRO'sunu kaydedin.İstediğiniz kaydetme klasörünü seçin ve dosyayı TIFF Formatında saklamak için Kaydet'e tıklayın. Ardından, Tüm İzler, Perinükleer İzler ve Telenükleer İzler başlıklı üç ana klasör oluşturun. Her bir ana klasörde birden başlayarak işlenecek her görüntü için numaralandırılmış bir alt klasör oluşturun.Her görüntü klasörüne iki rutin optimizasyon ek dosyasının bir kopyasını ekleyin. Varsayılan mat dosyası sürümünü tanımlamak veya değiştirmek için, Ortam bölümündeki Ana Sayfa sekmesine gidin ve Tercihler'e tıklayın. Ardından MATLAB'ı seçin.Bilgisayarda MATLAB yazılımını açın, Menü çubuğuna gidin, uygulamaları seçin ve Mitometer'ı açın. 3D Başlat'ı seçin ve piksel boyutunu 0,1395089 mikrometreye, kareler arasındaki süreyi 15 saniyeye, z düzlemi sayısını 8'e ve z düzlemleri arasındaki eksenel mesafeyi 0,418809 mikrometreye ayarlayın. Girilecek görüntüleri seçin.Şimdi, Mitometre yan menüsüne gidin, Görüntü'yü seçin ve Vurgulanmış Seç'i tıklayın. Mitometre Menü çubuğuna gidin, Parçaları Seç'i ve ardından Parça Görünümleri'ni seçin. Ardından, Tüm Parçalar, Telenükleer veya Perinükleer Seçenekler arasından seçim yapın.Txt'ye kaydet'i seçerek sonuçları bir metin dosyasına kaydedin ve sonuç dosyalarını oluşturulan klasörlere çıkarın. Görüntü kodlaması için anahtarı içeren rastgeleleştirme xlsx dosyasını hazırlayın. A sütununa birden başlayarak ardışık tamsayılar dizisi ekleyin, B sütununu analitik değişkenleri oluşturan alfasayısal karakterlerle doldurun.Yürütülebilir mlx'e çift tıklayın, klasör sayısını girin, Klasörün dizinini belirtin'e tıklayın ve Dizini Kaydet'i seçin. Çıktı dosyasında e-tablo adını seçin ve Çalıştır'ı tıklayın. Bunu takiben, gerekli istatistiksel analizi yapın.İşlemden sonra mitokondrinin temsili görüntüleri, ilgili yüzey grafikleri ve otomatik segmentasyon sunulmaktadır. AM580 ile tedavi edilen hücrelerde ortalama mitokondriyal uzunlukta önemli bir azalma gözlenmiştir. Mitokondriyal yüzey alanı, AM580 ve BMS493 ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde azaldı.Mitokondriyal hacim için normalize edilen TMRM yoğunluğu, retinoik asit ve CH55 ile tedavi edilen hücrelerde önemli bir azalma gösterdi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...