dihydroethidium &#40;dhe&#41; staining of hepatocarcinoma cells for the quantification of reactive oxygen species &#40;ros&#41;

כימות ROS חדשני באמצעות דיהידרואתידיום בתאי סרטן הכבד

Reactive oxygen species (ROS) are a group of naturally occurring, highly reactive, and temporally unstable chemical radicals formed as a part of the normal cellular metabolism in&#160;cells. ROS plays a key and essential role in the modulation of normal physiological and biochemical processes occurring in cells1,2. The main source of ROS production in cells is from the mitochondrial electron transport chain (ETC) pathway as a part of the normal bioenergetic cycle. Significant additional sources of ROS production include enzymatic reactions such as cellular NADPH oxidases in cells. Metabolism of food molecules (e.g., glucose) occurs via the oxidative phosphorylation pathway in the mitochondrial matrix. A baseline level of ROS production is essential to regulate normal physiological cell signaling processes. Many key protein molecules that are part of the glucose metabolic signaling pathways (e.g., Akt and PTEN) are known to respond to intracellular ROS levels. Additionally, ROS are produced by various intracellular enzymes such as xanthine oxidase, nitric oxide synthase, and peroxisomal constituents as a part of the cellular enzymatic pathways1,2. In contrast to the natural sources of ROS, certain environmental factors, such as xenobiotics, infectious agents, UV light, pollution, cigarette smoking, and radiation, also lead to excessive production of ROS, which are a key driver of intra-cellular oxidative stress1,3. Elevated cellular oxidative stress can cause damage to native biomolecules inside a cell, such as lipids, proteins, and DNA, causing various diseases such as cancer, diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation, and neurodegenerative disorders1,3,4. Therefore, accurate measurements of ROS are essential to understand&#160;the cellular mechanisms involved in oxidative stress-induced disease pathophysiology.
Due to the short timescales of ROS production and elimination inside cells, quantitative measurements of various ROS radicals remains a challenge. Methods such as electron paramagnetic resonance (EPR)5, high-pressure liquid chromatography (HPLC), and fluorescence probe-based imaging are used to measure the various cellular ROS6. While methods such as EPR and HPLC yield quantitatively accurate estimates, these methods involve the destruction of the cellular spatial morphology and are usually in the form of global and bulk measurements of a sample. In contrast, imaging-based methods such as fluorescence probe-based methods retain the cellular morphology and spatial context of the ROS generation. However, the specificity of various fluorescence probes for different types of ROS radicals has not been well-established7,8. Several fluorescent probes such as dihydroethidium (DHE), dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethyl anthracene (DMA), 2,7 dichlorodihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF), and MitoSox are available for ROS detection commercially. In the past decades, DHE, MitoSox, and DCFH-DA are the commonly used fluorescent dyes to measure ROS in cells and tissues8,9. DCFH-DA is a widely used dye for detecting intracellular H2O2 and oxidative stress. Despite the popularity of DCFH-DA, multiple previous studies have shown that it cannot be reliably used to measure intracellular H2O2 and other ROS levels8,9,10,11,12,13,14.
In contrast, the fluorescent probe dihydroethidium (DHE) shows a specific response to the intra-cellular superoxide radical (O2-). While the superoxide radical is one of many of the ROS species observed in cells, it is an important radical involved in the reduction of transition metals, conversion to peroxynitrate, and formation of hydroperoxides, among other intracellular effects. DHE is quickly taken up by the cells and has a fluorescence emission in the red wavelength range15. Upon reaction with superoxide radical specifically, DHE forms a red fluorescent product, 2-hydroxy ethidium (2-OH-E+). Thus, DHE may be considered as a specific probe for superoxide detection. However, DHE can also undergo nonspecific oxidation with ONOO- or OH., H2O2, and cytochrome c to form a second fluorescence product, ethidium E+, which can interfere with the measured 2-OH-E+ levels. However, these 2-OH E+ and E+ products, in combination, represent a major part of the total cellular ROS species observed inside a cell when stained with DHE. E+ intercalates into DNA, greatly enhancing its fluorescence8,9,10,11,13,14,15,16. Since the fluorescence spectra of ethidium and 2-hydroxy ethidium only differ slightly, the majority of ROS levels seen in a cell secondary to superoxide production can be detected and measured using DHE fluorescence products. These ROS species are identified using 480 nm wavelength excitation and 610 nm wavelength emission15,16,17.
In addition to choosing a specific fluorescent ROS detection probe, it is important to choose a sensitive method of detection to measure intracellular ROS. Accurate assessment of intracellular ROS levels is thus key to identifying disturbed redox balance states occurring in diseased cells or cells that have been exposed to various environmental stressors such as radiation, toxicological compounds, and genotoxic agents18. Since ROS is a commonly occurring phenomenon in cells that is responsible for regulating a variety of cell signaling activities, robust methods of detection of ROS are essential. To enable such high-throughput evaluation of ROS production within cells, this protocol uses a high-content screening (HCS) platform to measure the ROS species. The current protocol allows the high-throughput analysis of intracellular ROS production, which is of critical importance in many toxicology studies19. This protocol aims to provide an easy and versatile solution to detect and measure intracellular ROS in adherent hepatocellular carcinoma cells. The chemical reagents of H2O2 and menadione are used as potent ROS stimulators to measure the relative levels of ROS production in a controlled and high throughput setting. This protocol may be fine-tuned to measure ROS production in adherent and nonadherent cells under appropriate conditions, as necessary.

מחבר זרקור: מדידה בתפוקה גבוהה של רמות ROS תוך תאיות בקווי הפטוצלולר

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

Our lab studies the impact of environmental pollutants, like heavy metals, on liver function and diseases related to reactive oxygen species production. This protocol aims to quantitatively measure ROS levels in cells using a dihydroethidium fluorescence probe. This protocol uses a high-content screening platform to quantitatively measure intracellular ROS species levels in hepatocellular lines.Measuring intercellular ROS level accurately is of critical importance in high-throughput toxicology study, which is a key area of interest in our lab. DHE fluorescence is a highly specific method for measuring total ROS levels, particularly targeting the superoxide radical, are giving it a significant advantage over other commonly used ROS fluorescence probe. Additionally, this protocol offer the unique ability to measure total cellular ROS level in a high-throughput platform.Our protocol is a robust and reproducible choice to characterize intracellular total ROS production. High-throughput approaches to measure ROS levels are helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology, which will be our focus in the future.

צביעת דיהידרואתידיום (DHE) של תאי הפטוקרצינומה לכימות מיני חמצן תגובתי (ROS)

כדי להתחיל, זרע נפח 200 מיקרוליטר של 10, 000 תאי קרצינומה hepatocellular לתוך צלחת 96 באר עם DMEM ו 10% FBS. לדגור על התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח תחת 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החליפו את תרבית החומר וטפלו בתאים בריכוזים משתנים של מי חמצן ומנאדיון.להמיס חמישה מיליגרם של DHE במיליליטר אחד של DMSO. עבור פתרון העבודה, לדלל aliquot 100 מיקרומול עם מדיה DMEM שחומם מראש לריכוז של 10 מיקרומול. מערבלים את תמיסת הצבע העובדת למשך 5 עד 10 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון.כעת הסר את אמצעי הבדיקה מכל באר לפני שעומדים תאי הקרצינומה. לאחר מכן שטפו בעדינות כל באר עם PBS. פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת צבע עובד לתוך כל באר.דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות. הסר את המדיה המכילה DHE מכל באר. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBS.עכשיו, פיפטה 200 מיקרוליטר של PBS המכיל Hoechst 33342 צבע צביעה גרעינית לתוך כל באר. לאחר הדגירה, להעביר את הצלחת לפלטפורמת סינון תוכן גבוהה. הפעל את תוכנת הסינון Cellomics CX7 בעלת התוכן הגבוה.כייל את פלטפורמת ההדמיה בהתאם למפרטי היצרן. פתח את פרמטרי המערכת הספציפיים למותג הצלחת במסד הנתונים של המכשיר. לאחר מכן, מניחים בזהירות את הצלחת עם הדגימות על השלב המחומם של מערכת ההדמיה.ודא שהצלחת ממוקמת היטב ובכיוון הנכון. לאחר מכן לחץ בעדינות כלפי מטה על צלחת המיקרו כדי להבטיח שהיא מונחת שטוחה על הבמה. לאחר שהלוח ממוקם כראוי, לחץ והחזק את מקש Control.לאחר מכן לחץ על Control and OK כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח Plate Load/Unload . כדי לבחור את פרמטרי ההדמיה, פתח את מצב הפעלת היעד בממשק Cellomics BioApplications. צור פרוטוקול חדש לרכישת נתונים דו-ערוציים התואם לצביעה גרעינית ולגשושית פלואורסצנטית DHE.לאחר מכן, ציין את המטרות הנדרשות לרכישת תמונה ולאחר מכן בחר את ההגדלה המתאימה. כעת ציין את זמן החשיפה, כיפוף המצלמה ומרווח מחסנית z. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, זהה את אובייקט המעקב העיקרי המעניין באמצעות האלגוריתמים השונים במכשיר.לאחר פילוח האובייקט שזוהה, אמת את האובייקט הראשי בהתבסס על פרמטרי הגודל, הצורה והעוצמה הספציפיים הייחודיים לכל סוג תא. הגדר את אזור העניין סביב האובייקט והגדר מעגל של 20 מיקרומטר סביבו. לחץ על הכרטיסייה אפיון אוכלוסייה, ולאחר מכן הגדר את מגבלת הסריקה ל -1000 תאים לכל באר עם מינימום של 10 אובייקטים לכל שדה.כעת לחץ על הפעל תצוגה כדי לסרוק כל צלחת באר. לאחר מכן הפעל את תוכנת ניתוח התצוגה וייצא את פרמטרי הנתונים הכמותיים בפורמט CSV לניתוח נוסף. חשיפה למי חמצן הביאה לתוספת מובהקת סטטיסטית של פלואורסצנטיות המושרה על ידי ROS בכל קווי התאים באופן תלוי מינון.עם מנדיון, תאי JHH-4 הראו תוספת תלוית מינון בעוצמה פלואורסצנטית. עם זאת, ההבדל המשמעותי בפלואורסצנטיות נצפה רק בריכוזים גבוהים יותר בשני קווי התאים האחרים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Dihydroethidium &#40;DHE&#41; Staining of Hepatocarcinoma Cells for the Quantification of Reactive Oxygen Species &#40;ROS&#41;

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...