Para começar, transfira 20 mililitros da amostra de uva fermentada para um tubo de tampa rosqueado estéril de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de água fria no tubo e vórtice para homogeneização. Centrifugar a amostra a 800 G durante um minuto a quatro graus Celsius.
Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 50 mililitros e centrífuga a 3000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Transfira a suspensão celular para um tubo de tampa de rosca de dois mililitros e centrífuga a 14.000 G por dois minutos.
Agora ressuspenda o pellet em 978 microlitros de tampão fosfato de sódio de pH 7,4 e 122 microlitros de tampão de DNA. Vórtice o tubo e coloque-o a quatro graus Celsius por 45 minutos a uma hora. Transfira um mililitro da amostra para uma solução de lise, um tubo e aperte a tampa.
Homogeneizar a amostra três vezes em um moedor batedor de contas por 60 segundos cada. Em seguida, centrifugar o tubo E da matriz de lise por um minuto a 16, 800 G. Transfira o supernannt em um microtubo limpo e adicione 250 microlitros de solução de precipitação de proteína ao tubo. Agite o tubo 10 vezes para misturar o conteúdo.
Centrifugar a amostra por cinco minutos a 16, 800 G e transferir o sobrenadante para um tubo estéril de 15 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de suspensão de matriz de ligação ao sobrenadante e misture invertendo os tubos por dois minutos antes de colocá-los em rack por três minutos. Após a remoção de um mililitro do sobrenadante, ressuspenda a matriz no sobrenadante restante.
Transfira 600 microlitros da mistura para um tubo de filtro de spin e centrífuga. Em seguida, decantar o fluxo e adicionar 500 microlitros de solução de lavagem no tubo do filtro de spin. Retire o filtro de rotação e coloque-o em um tubo de captura fresco por cinco minutos.
Após a secagem, adicione 50 microlitros de água morna sem DNAse na membrana do filtro e agite suavemente a matriz com uma ponta de pipeta. Centrifugar a 14, 500 G por um minuto para eluir o DNA. Coloque a amostra em um gel de agarose.
Finalmente, meça a concentração de DNA.
