O financiamento do Appalachian State University Research Council (URC) e da bolsa CAPES Print Travel que apoiou a visita da FAO à Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil, são reconhecidos com gratidão. O presente estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código 001. O ECPDM agradece a bolsa CAPES Print Travel que apoiou sua visita à Appalachian State University. ECPDM é pesquisador fellow 2 do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).

1. Produção experimental de vinho
<ol><li>Obtenha uvas Traminnette do vinho Dynamis Estate em Jonesville, vinhedo da Carolina do Norte, destale e esmague para liberar o mosto em dois fermentadores abertos separados de 600 L e deixe em cascas por cerca de 4 dias com as tampas ligadas.</li>
	<li>Perfure as tampas uma vez por dia para manter as peles molhadas e limitar a produção de ácido volátil (VA). OBS: A ideia é que muitos dos precursores aromáticos (monoterpenos) fiquem situados nas cascas e deixem o suco em contato com a pele para aumentar o potencial aromático do vinho.</li>
	<li>Após 4 dias, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Esta levedura foi selecionada por ser um fermentador forte e está associada ao reforço do caráter varietal no vinho das uvas.</li>
	<li>Em um tanque, Traminette R, adicione 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver a 17,7 e 20 g/hL Fermaid O e 12,5 g/hL Fermaid K a 13,1 g/hL para alcançar a segurança de fermentação, enquanto no outro tanque Traminette L, adicione 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc quando o brix estiver em 17,1. Adicione também 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver em 13,4 para realçar o caráter varietal do vinho.</li>
	<li>Colher amostras duplicadas de mosto (dia 1), levedura adicionada (dia 4), mosto fermentado (dia 15) e amostras de vinho acabado (dia 30) e manter a -20 °C antes da extracção de ADN e análise metagenómica.</li>
</ol>2. Extração de DNA para metagenômica
<ol><li>Manter todas as amostras duplicadas obtidas acima no gelo até a primeira centrifugação.</li>
	<li>Transferir 20 mL da amostra fermentada para um tubo estéril de tampa de rosca de 50 mL.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de água fria e homogeneizar (vórtice). Centrifugar durante 1 min a 800 x g a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 ml. NOTA: Esta etapa removerá os sólidos da amostra.</li>
	<li>Repita o passo 2.3 duas vezes e junte os sobrenadantes no mesmo tubo.</li>
	<li>Centrifugar sobrenadante a 3.000 x g a 4 °C por 20 min para peletizar as células. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS, transferir para um tubo de tampa de rosca de 2 mL e centrifugar a 14.000 x g por 2 min. Realize mais duas lavagens usando PBS.</li>
	<li>Nesta etapa, congele os pellets a -20°C ou siga o passo 2.8. É importante que todas as amostras sejam tratadas da mesma forma.</li>
	<li>Adicionar 978 μL de tampão fosfato de sódio. Preparar tampão fosfato de sódio, adicionar 3,1 g de NaH2PO4· H2O e 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) para destilar H2O para fazer um volume de 1 L, e ajustar o pH para 7,4.</li>
	<li>Adicionar 122 μL de tampão de DNA (kit de spin de DNA) e vórtice.</li>
	<li>Deixe descansar na geladeira (4 °C) por 45 min-1 h. Vórtice as amostras a cada 15 min. Esta etapa pode ser deixada durante a noite (o/n) ou até que esteja pronta para continuar usando o kit de spin de DNA.</li>
	<li>Transfira 1 mL de amostra para um tubo de solução de lise 1 (kit de spin de DNA) e aperte a tampa (escreva o número da amostra na lateral do tubo e não na tampa; os reagentes do kit removerão qualquer coisa escrita na tampa).</li>
	<li>Homogeneizar a amostra em um moedor batedor de contas (6,5 m/s, CY: 24 x 2) por 60 s três vezes. Se o moedor de contas tiver o dispositivo para colocar gelo, coloque 50 g de gelo seco sob os tubos. Caso contrário, manter as amostras em gelo úmido por 5 min entre cada etapa de homogeneização.</li>
	<li>Centrífuga Lysing Matrix E tubos (kit de spin DNA) por 1 min a 16800 x g (ou velocidade máxima).</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um microtubo limpo. Em seguida, adicione 250 μL de reagente de solução de precipitação proteica (PPS) (kit de spin de DNA) e misture agitando o tubo manualmente 10 vezes.</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 16800 x g para pellet o precipitado.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um tubo estéril de 15 mL. Adicionar 1 mL de suspensão de matriz de ligação (kit de spin de DNA) ao sobrenadante. NOTA: Ressuspenda a suspensão da matriz de ligação antes de usar até que ela fique homogênea.</li>
	<li>Inverta os tubos manualmente por 2 min, em seguida, deixe os tubos em um rack por 3 min (para permitir o assentamento da matriz de sílica).</li>
	<li>Retire cuidadosamente 1 ml do sobrenadante. Ressuspenda a matriz no sobrenadante restante.</li>
	<li>Transfira 600 μL da mistura para um tubo de filtro de spin (kit de spin de DNA) e centrífuga por 1 min a 14500 x g.</li>
	<li>Adicione a mistura restante e centrifuga.</li>
	<li>Decantar o fluxo e adicionar 500 μL de solução de lavagem (kit de spin de DNA) no tubo do filtro de spin e centrifugar por 1 min a 14500 x g (certifique-se de adicionar EtOH à solução de lavagem; consulte o manual do produto). Decantar o fluxo e repetir a lavagem mais duas vezes (3 lavagens no total).</li>
	<li>Decantar o fluxo e centrifugar por mais 2 min a 14.500 x g para secar a matriz da solução de lavagem residual.</li>
	<li>Retire o filtro de spin e coloque-o em um tubo de captura fresco (kit de spin de DNA). Seque o filtro de spin ao ar por 5 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Aqueça a água livre de DNAse (kit de spin de DNA) a 55 °C por 5 min. Adicione 50 μL de água sem DNAse e agite suavemente a matriz na membrana do filtro com uma ponta de pipeta para uma eluição eficiente do DNA. Deixe as amostras repousarem em RT por 1 min e, em seguida, centrifugar por 1 min a 14500 x g para eluir o DNA.</li>
	<li>Coloque as amostras no gelo. Carregar a mistura da amostra (2 μL de amostra + 2 μL de água + 1 μL de tampão de carga) num gel. Medir a concentração de DNA.</li>
	<li>Conservar as amostras a -20 °C.</li>
	<li>Use um espectrofotômetro para quantificar o DNA extraído. NOTA: Um volume de 1 μL de DNA foi descartado e quantificado, e a qualidade do DNA foi observada em uma proporção A260/A280.</li>
</ol>3. Eletroforese de DNA
<ol><li>Preparar gel de agarose a 1% em tampão 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL para um mini gel, 70-100 mL para um gel médio). Pese agarose+tampão, ferva no micro-ondas para derreter a agarose, pese novamente e adicione dH2O ao peso original. Arrefecer a solução de agarose a 55-60 °C e deitar na formadora de gel com o conjunto do pente. Deixe o gel solidificar.</li>
	<li>Adicionar 1 μL de tampão de carregamento de 10x gel à amostra (10 μL) e carregar no gel junto a um marcador de peso molecular. Passe de negativo (preto) para positivo (vermelho) a 100-115 V (gel grande) ou 90 V (mini gel) até que o corante azul esteja perto do fundo.</li>
	<li>Coloração em gel por 30 min em brometo de etídio de 1 μL/mL ou verde SYBR (luvas e óculos de nitrilo necessários), enxaguar em água e visualizar sob fonte de luz ultravioleta (UV). A partir das amostras duplicadas, selecione o maior rendimento para processamento posterior.</li>
</ol>4. Sequenciamento de alto rendimento
<ol><li>Amplificar a região hipervariável V4 do gene 16S rRNA usando os primers específicos 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Definir as condições de reação em cadeia da polimerase (PCR) em 94 °C por 2 min, 30 ciclos de 94 °C por 20 s, 58 °C por 20 s, 65 °C por 1 min e 65 °C por 10 min (extensão final).</li>
	<li>Realizar reações de PCR com um master mix de PCR de alta fidelidade (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Gere bibliotecas com kit de preparação de biblioteca de DNA e, em seguida, sequencie usando sequenciamento de extremidade emparelhada em uma plataforma de sequenciamento. NOTA: Aqui, as bibliotecas geradas com o NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit foram sequenciadas usando sequenciamento Illumina pareado (2 × 250 pb) na plataforma novaseq6000.</li>
	<li>Siga as etapas de sequenciamento:<ol><li>Passo 1: Cisalhe o DNA com uma enzima, geralmente por um método que seleciona para um tamanho geral.<ol><li>Adicionar 3,5 μL de tampão de sequenciação e 1,5 μL de mistura enzimática a 25 μL de ADN (cerca de 1 μg), misturar 10 vezes com uma pipeta e girar rapidamente.</li>
			<li>Coloque em um termociclador com as seguintes condições: pré-aqueça a tampa a 75°C, (1) 30 min para 20 °C (2) 30 min para 65 °C (3) segure a 4°C.</li>
		</ol></li>
		<li>Passo 2: Adicionar adaptadores via ligadura<ol><li>Adicionar 15 μL de mistura mestre de ligadura, 1,25 μL de adaptador, 0,5 μL de intensificador de ligadura e 30 μL de mistura de DNA de preparação final com uma pipeta.</li>
			<li>Incubar a 20 °C durante 15 minutos num termociclador e, em seguida, adicionar 1,5 μL de enzima reagente de excisão específica para uracila (USER) à mistura de ligadura para obter um total de 48,26 μL. Incubar 37 °C durante 15 minutos.</li>
			<li>Adicione 43,5 μL de esferas magnéticas ao DNA de ligadura do adaptador, misture 20 vezes com uma pipeta e incube por 5 min em RT. Separe as contas com um rack magnético, incube por 5-10 min e descarte o sobrenadante.</li>
			<li>Lave o pellet com 100 μL de etanol 80%, seque por 30 s e lave novamente. Contas eluídas e pellet em 8,5 μL de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, misturar com uma pipeta e incubar em TR por 2 min.</li>
			<li>Incubar no rack magnético e remover 7,5 μL de DNA eluído como sobrenadante. Coloque a eluição em um tubo novo e realize uma etapa de PCR.</li>
			<li>Primeiro, adicione 12,5 μL de mistura mestra, 2,5 μL de primer índice i7 primer e 2,5 μL de primer universal de PCR/primer i5 a 7,5 μL de DNA ligado a adaptador para obter 25 μL de mistura de reação de PCR. Use a seguinte condição de PCR: pré-aqueça a tampa a 103 °C. 98 °C por 30 s, 98 °C por 10 s, 65 °C por 75 s, 65 °C por 5 min e mantenha a 4 °C após 10 ciclos.</li>
			<li>Limpe o DNA amplificado de 25 μL. Adicionar 22,5 μL de esferas magnéticas e misturar 20 vezes. Incubar em TR por 5 min e remover 50 μL do sobrenadante. Lave as contas com 100 μL de etanol 80% e retire todo o etanol secando as contas suavemente por 30 s.</li>
			<li>Ressuspenda as contas castanhas escuras em 16 μL de água, misture 20 vezes com uma pipeta e coloque no rack magnético por 30-60 s. Transferir 15 μL para um novo tubo.</li>
			<li>Determinar a concentração de DNA usando um fluorômetro. Misture 90 μL de tampão + 1 μL de corante + 2 μL de amostra de biblioteca de DNA e leia a concentração. Diluir o DNA em 2 nM, carregar 27-30 μL na célula de fluxo e colocá-lo no sequenciador.</li>
		</ol></li>
		<li>Passo 3: Sequenciar os adaptadores, hibridizar as bibliotecas geradas acima para a matriz da célula de fluxo padronizada e capturar o DNA de acordo com as instruções do fabricante. Use-o como modelo para a segunda síntese.<ol><li>Em seguida, amplie a segunda fita em um cluster clonal. Linearize o cluster e bloqueie os sites ativos. Adicionar primer de sequenciamento para fornecer um local para sequenciamento por síntese na sequência de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Quimicamente, os nucleotídeos modificados ligam-se à fita molde de DNA usando complementaridade natural. Cada nucleotídeo tem uma etiqueta fluorescente e um terminador reversível que bloqueia a inclusão da próxima base. Portanto, a presença de um sinal fluorescente indica qual nucleotídeo está inserido, e o terminador é clivado para a próxima base se ligar.</li>
		</ol></li>
		<li>Passo 4: Amplificar a fita de ligação única para dar agrupamentos de sequências que são sequenciadas em conjunto por síntese. NOTA: Os clusters fornecem um sinal mais brilhante do que uma única fita através de varredura bidirecional e química de sequenciamento de dois canais. O software de sequenciamento transfere automaticamente os arquivos de chamada base (*.cbcl) para o local da pasta de saída especificada para análise de dados.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioinformática
<ol><li>Gere os dados de sequência como arquivos FASTQ. Analise para incluir as seguintes partes.<ol><li>Parte I:<ol><li>Salve os arquivos FASTQ obtidos do sequenciador, clique para abrir um arquivo de planilha e crie arquivos de mapeamento/metadados.</li>
			<li>Abra o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), carregue os arquivos FASTQ, leia o QC, filtre e corte no QIIME222. Deposite as sequências brutas como sequence read archive (SRA) e GenBank no NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)</li>
		</ol></li>
		<li>Parte II: Vá para o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), faça as leituras de extremidade emparelhada desmultiplexadas, substituição de filtros e erros de quimera e mescle usando DADA223. Utilizar o classificador Naive Bayes treinado no banco de dados Silva versão 132 99% OTU para realizar a atribuição taxonômica bacteriana a 97% de similaridade24.</li>
		<li>Parte III: Abra o site do MicrobiomeDB, clique para fazer upload de arquivos e gere curvas de diversidade alfa, beta, abundância relativa e rarefação (https://microbiomedb.org/mbio/app) da OTU.</li>
		<li>Parte IV: Abra uma planilha e transfira dados para fazer mapas de calor, diagramas de Venn e tamanho de efeito de análise discriminante linear (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Análise estatística
<ol><li>Abra o QIIME222 e determine as diferenças significativas na diversidade alfa entre os grupos usando o script de significância de grupo alfa. Este também realizará o teste de Kruskal-Wallis.</li>
	<li>Determinar as diferenças na diversidade beta entre os grupos usando PERMANOVA, incluindo um teste pareado25.</li>
	<li>Obter as diferenças significativas na estrutura da comunidade bacteriana entre os grupos usando MicrobiomeDB. Um valor de p ≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.</li>
</ol>

Traçando o perfil da comunidade bacteriana em uvas usando metagenômica Amplicon

<ol>
	<li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette,+gew&#252;rztraminer,+and+riesling+winegrapes.">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gew&#252;rztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li><li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette.">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li><li>Reisch, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DADA2:+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data.">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Anderson, M. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities:+A+review.">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).</li><li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations.">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li><li>V&#237;quez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+the+green+wall:+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research.">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li><li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007 (2019).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo de metagenômica começa a partir da amostragem do mosto de uva, e quando a levedura foi adicionada ao mosto, o vinho fermentador e amostras finais de vinho. Isso foi seguido pela extração de DNA duplicado que foi extraído com sucesso dessas amostras. As quantidades obtidas variaram em concentração de 15 ng/μL a 87 ng/μL. Isso mostra que o protocolo de extração de DNA é eficaz para estudos metagenômicos do vinho. Embora a qualidade do DNA em A260/A280 varie, isso pode ser atribuído a diferentes pa...

A uva Traminette caracteriza-se pela produção de vinhos de qualidade superior, além de rendimento apreciável e resistência parcial a diversas infecções fúngicas 1,2,3. A fermentação natural das uvas depende de microrganismos associados, ambiente de produção de vinho e vasos de fermentação 4,5. Muitas vezes, muitas vinícolas dependem de leveduras e bactérias selvagens para fermentação, produção de álcool, ésteres, aroma e desenvolvimento de sabor6.
O objetivo deste estudo é examinar a composição bacteriana de uvas e monitorar sua dinâmica durante a fermentação. No entanto, o uso moderno de culturas iniciadoras, como a Saccharomyces cerevisiae, para fermentação primária, onde o álcool é produzido, é comum a diferentes estilos de vinho7. Além disso, a fermentação secundária, em que o ácido málico é descarboxilado por Oenococcus oeni em ácido lático, melhora o perfil organoléptico e gustativo do vinho e reduz a acidez do vinho 8,9. Com os recentes avanços no uso de métodos independentes de cultura, agora é possível determinar diferentes micróbios associados à uva vinífera e às espécies que são transferidas para o mosto e participar da fermentação em diferentes momentos até o produto final10.
Os papéis e a dinâmica de bactérias selvagens de diferentes uvas transferidas para o mosto durante a fermentação do vinho são pouco compreendidos. A taxonomia de muitas dessas bactérias ainda não é conhecida, ou suas propriedades fenotípicas não estão caracterizadas. Isso faz com que sua aplicação na fermentação da cocultura ainda seja pouco utilizada. No entanto, a análise microbiológica baseada em cultura tem sido utilizada para determinar a população bacteriana associada à uva e ao vinho10. Sabe-se que o plaqueamento seletivo de cultura é tedioso, propenso à contaminação, tem baixa reprodutibilidade e o resultado pode ser duvidoso; Também perde espécies bacterianas cujas necessidades de crescimento são desconhecidas. Estudos prévios indicam que metodologias baseadas no gene 16S rRNA, independentes de cultura, oferecem uma abordagem mais confiável e custo-efetiva para caracterizar comunidades microbianas complexas11. Por exemplo, o sequenciamento das regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA tem sido empregado com sucesso para estudar bactérias em folhas de uvas, bagas e vinho 12,13,14. Estudos têm mostrado que o uso de metabarcoding de 16S rRNA ou sequenciamento metagenômico completo é adequado para estudos de microbioma15. Estão surgindo informações sobre a possível ligação da diversidade bacteriana aos seus atributos metabólicos durante a produção do vinho, o que poderia auxiliar na determinação das propriedades enológicas e do terroir16.
A necessidade de maximizar as vantagens das ferramentas metagenômicas utilizando o sequenciamento de próxima geração (NGS) para estudar a ecologia microbiana da uva e do vinho tem sido enfatizada16,17. Além disso, o uso de métodos independentes de cultura baseados em sequenciamento de alto rendimento para traçar o perfil da diversidade microbiana do ecossistema alimentar e fermentativo tornou-se muito relevante e valioso para muitos laboratórios, sendo recomendado para uso industrial18,19. Fornece uma vantagem de detecção e perfil taxonômico das populações microbianas presentes e a contribuição de micróbios ambientais, sua abundância relativa e diversidade alfa e beta20. O sequenciamento da região variável da região 16S tornou-se um importante gene de escolha e tem sido utilizado durante diferentes estudos ecológicos microbianos.
Enquanto muitos estudos se concentram em fungos, especialmente leveduras, durante a fermentação do vinho21, este estudo relatou o sequenciamento de amplicon 16S e ferramentas de bioinformática usadas para estudar as bactérias durante a fermentação de uvas Traminette para produção de vinho.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI USA</td>
			<td>V3121</td>
			<td>Electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep DNA spinKit for soil&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td>
			<td>116560-200</td>
			<td>DNA extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC software</td>
			<td>Babraham Institute, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatics&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermaid O</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Fidelity PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>F630S</td>
			<td>Polymerase chain reaction for sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>NEB #E7103</td>
			<td>DNA Library Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq Control Software (NVCS)</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq6000 platform&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuiBit</td>
			<td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickdrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Molecular device, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td>DNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimula Sauvignon Blanc</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the bacterial community of fermenting traminette grapes during wine production using metagenomic amplicon sequencing

Os avanços na tecnologia de sequenciamento e o acesso relativamente fácil ao uso de ferramentas de bioinformática para traçar o perfil das estruturas da comunidade microbiana têm facilitado uma melhor compreensão dos micróbios cultiváveis e não cultiváveis em uvas e vinhos. Durante a fermentação industrial, micróbios, conhecidos e desconhecidos, são frequentemente responsáveis pelo desenvolvimento de produtos e dessabor. Portanto, o perfil das bactérias da uva ao vinho pode permitir uma fácil compreensão da dinâmica microbiana in situ . Neste estudo, as bactérias do mosto de uvas Traminette submetidas à fermentação, e o vinho final foi submetido à extração de DNA que resultou em 15 ng/μL a 87 ng/μL. O amplicon 16S da região hipervariável da região V4 foi sequenciado, bactérias relativamente abundantes constituídas pelos filos Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguidas pelos Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Uma análise do diagrama de Venn das unidades taxonômicas operacionais únicas compartilhadas (OTU) revelou que 15 filos de bactérias eram comuns ao mosto de uva, ao estágio de fermentação e ao vinho final. Filos não relatados anteriormente foram detectados usando o sequenciamento do amplicon 16S, assim como gêneros como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. Testou-se a variação no uso de nutrientes orgânicos no vinho e seu impacto sobre as bactérias; Tanque Traminette R contendo Fermaid O e Traminette L estimulado com Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. A diversidade alfa usando o teste de Kruskal-Wallis determinou o grau de equitabilidade. A diversidade beta indicou uma mudança nas bactérias no estágio de fermentação para os dois tratamentos, e as bactérias finais do vinho pareceram semelhantes. O estudo confirmou que o sequenciamento de amplicon 16S pode ser usado para monitorar as mudanças bacterianas durante a produção de vinho para apoiar a qualidade e melhor utilização das bactérias da uva durante a produção de vinho.

Traminette grape is characterized by production of superior wine quality, in addition to appreciable yield and partial resistance to several fungal infections1,2,3. The natural fermentation of grapes relies on associated microorganisms, wine production environment, and fermentation vessels4,5. Oftentimes, many wineries rely on wild yeast and bacteria for fermentation, production of alcohol, esters, aroma, and flavor development6.
The goal of this study is to examine the bacterial composition of grapes and monitor their dynamics during fermentation. Although, the modern use of starter cultures such as Saccharomyces cerevisiae for primary fermentation, where alcohol is produced, is common to different wine styles7. In addition, secondary fermentation, where malic acid is decarboxylated by Oenococcus oeni to lactic acid, improves the organoleptic and taste profile of the wine and reduces the acidity of wine8,9. With the recent advances in the use of culture-independent methods, it is now possible to determine different microbes associated with the wine grape and the species that are transferred to must and participate in the fermentation at different times up to the final product10.
The roles and dynamics of wild bacteria from different grapes transferred to the must during wine fermentation are poorly understood. The taxonomy of many of these bacteria is not even known, or their phenotypic properties are uncharacterized. This makes their application in coculture fermentation still poorly underutilized. However, microbiological culture-based analysis has been used to determine the bacterial population associated with grapes and wine10. It is widely known that selective culture plating is tedious, prone to contamination, has a low reproducibility, and output can be doubtful; it also misses bacterial species whose growth requirements are unknown. Previous studies indicate that culture-independent, 16S rRNA gene-based methodologies offer a more dependable and cost-effective approach to characterizing complex microbial communities11. For example, sequencing the hypervariable regions of the 16S rRNA gene has been successfully employed to study bacteria in grapes leaves, berries, and wine12,13,14. Studies have shown that the use of either 16S rRNA metabarcoding or whole metagenomic sequencing is suitable for microbiome studies15. There is emerging information about the possible linkage of bacterial diversity to their metabolic attributes during wine production, which could help in the determination of oenological properties and terroir16.
The need to maximize the advantages of the metagenomic tools using next-generation sequencing (NGS) to study the grape and wine microbial ecology has been emphasized16,17. Also, the use of culture-independent methods based on high throughput sequencing to profile microbial diversity of the food and fermentation ecosystem has become very relevant and valuable to many laboratories and is recommended for industrial use18,19. It provides an advantage of detection and taxonomic profiling of the present microbial populations and the contribution of environmental microbes, their relative abundance, and alpha and beta diversity20. The sequencing of the variable region of the 16S region has become an important gene of choice and has been used during different microbial ecological studies.
While many studies focus on fungi, especially yeast, during wine fermentation21, this study reported the 16S amplicon sequencing and bioinformatic tools used to study the bacteria during Traminette grapes fermentation for wine production.

Autor em destaque: explorando o microbioma de fermentação por meio do sequenciamento de última geração

Perfil da Comunidade Bacteriana de Fermentação de Uvas Traminette durante a Produção de Vinho utilizando Sequenciamento Metagenômico Amplicon

Research scope focuses on the understanding of the fermentation microbiome. This is to answer questions such as how diverse microbes in natural fermentation are, and what gene coding for metabolite is necessary for flavor and safety. One of the latest advancement in our field involves understanding how the dynamics of the microbiome correlate with the metabolic profile observed in fermented foods and beverages.The next generation sequence stands out as a pivotal technology that is currently driving advancements in our research field

A quantidade e a qualidade do DNA extraído do mosto de uvas, do vinho fermentado e do vinho final foram primeiramente determinadas; o valor da quantidade varia de 15-87 ng/μL (Tabela 1).
Sequenciamento e bioinformática O sequenciador de alta taxa de transferência do Illumina gerou um arquivo FASTQ que foi importado para o Nephele e visualizado na plataforma QIIME 226. Primeiramente, foi utilizado o software FastQ...

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Aqui, apresentamos um protocolo para descrever a metagenômica amplicon para determinar a comunidade bacteriana de uvas Traminette, uvas em fermentação e vinho final.

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

O escopo da pesquisa concentra-se na compreensão do microbioma fermentativo. Isso é para responder a perguntas como quão diversos micróbios na fermentação natural são, e qual gene codificador para metabólito é necessário para sabor e segurança. Um dos mais recentes avanços em nosso campo envolve a compreensão de como a dinâmica do microbioma se correlaciona com o perfil metabólico observado em alimentos e bebidas fermentados.A sequência de próxima geração se destaca como uma tecnologia fundamental que atualmente está impulsionando avanços em nosso campo de pesquisa

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

502 visualizações.  Appalachian State University. O escopo da pesquisa concentra-se na compreensão do microbioma fermentativo. Isso é para responder a perguntas como quão diversos micróbios na fermentação natural são, e qual gene codificador para metabólito é necessário para sabor e segurança. Um dos mais recentes avanços em nosso campo envolve a compreensão de como a dinâmica do microbioma se correlaciona com o perfil metabólico observado em alimentos e bebidas fermentados.A sequência de próxima geração se destaca ...

Vídeo: Autor em destaque: explorando o microbioma de fermentação por meio do sequenciamento de última geração

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have facilitated a better understanding of both culturable and non-culturable microbes in grapes and wine. During industrial fermentation, microbes, known and unknown, are often responsible for product development and off-flavor. Therefore, profiling the bacteria from grape to wine can enable an easy understanding of in situ microbial dynamics. In this study, the bacteria of Traminette grapes must undergoing fermentation, and the final wine were subjected to DNA extraction that yielded 15 ng/&#181;L to 87 ng/&#181;L. The 16S amplicon of the hypervariable region of the V4 region was sequenced, relatively abundant bacteria consisting of phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota and followed by the Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota, and Acidobacteriota. A Venn diagram analysis of the shared unique operational taxonomic units (OTU) revealed that 15 bacteria phyla were common to both grape must, fermenting stage, and final wine. Phyla that were not previously reported were detected using the 16S amplicon sequencing, as well as genera such as Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae. Variation in the organic nutrient use in wine and its impact on bacteria was tested; Traminette R tank containing Fermaid O and Traminette L stimulated with Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alpha diversity using the Kruskal-Wallis test determined the degree of evenness. The beta diversity indicated a shift in the bacteria at the fermentation stage for the two treatments, and the final wine bacteria looked similar. The study confirmed that 16S amplicon sequencing can be used to monitor bacteria changes during wine production to support quality and better utilization of grape bacteria during wine production.

Here, we present a protocol to describe amplicon metagenomic for determining the bacterial community of Traminette grapes, fermenting grapes, and final wine.

Biologia

DNA Extraction from Fermented Grape for Metagenomic Analysis

To begin, transfer 20 milliliters of the fermented grape sample into a sterile 50 milliliter screwed cap tube. Then add 10 milliliters of cold water into the tube and vortex for homogenization. Centrifuge the sample at 800 G for one minute at four degrees Celsius.Transfer the supernatant to a new 50 milliliter tube and centrifuge at 3000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in one milliliter of PBS. Transfer the cell suspension to a two milliliter screw cap tube and centrifuge at 14, 000 G for two minutes.Now resuspend the pellet in 978 microliters of sodium phosphate buffer of pH 7.4 and 122 microliters of DNA buffer. Vortex the tube and place it at four degrees Celsius for 45 minutes to one hour. Transfer one milliliter of the sample into a lysis solution one tube and tighten the cap.Homogenize the sample three times in a bead beating grinder for 60 seconds each. Then centrifuge the lysing matrix E tube for one minute at 16, 800 G.Transfer the supernannt into a clean microtube and add 250 microliters of protein precipitation solution to the tube. Shake the tube 10 times to mix the contents.Centrifuge the sample for five minutes at 16, 800 G and transfer the supernatant into a sterile 15 milliliter tube. Then add one milliliter of binding matrix suspension to the supernatant and mix by inverting the tubes for two minutes before placing them in rack for three minutes. After removing one milliliter of the supernatant, resuspend the matrix in the remaining supernatant.Transfer 600 microliters of the mixture into a spin filter tube and centrifuge. Then decant the flow through and add 500 microliters of wash solution into the spin filter tube. Remove the spin filter and place it in a fresh catch tube for five minutes.After drying, add 50 microliters of warm DNAse-free water on the filter membrane and gently stir the matrix with a pipette tip. Centrifuge at 14, 500 G for one minute to elute the DNA. Load the sample onto an agarose gel.Finally, measure the DNA concentration.

Extração de DNA de Uva Fermentada para Análise Metagenômica

High-Throughput Sequencing and Bioinformatic Analysis in Grape Must and Wine for Microbial Diversity

To begin, use specific primers 515f and 806r to amplify the V4 hypervariable region of the 16S rNA gene. Perform PCR using the given conditions. Next, add 3.5 microliters of sequencing buffer and 1.5 microliters of enzyme mix to the tube.After mixing and spinning the sample, set up a thermocycler reaction. Now, add the adapter ligation mixture into the tube and incubate at 20 degrees Celsius for 15 minutes in a thermocycler. Add 1.5 microliters of uracil specific extension reagent enzyme to the ligation mix, and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes.Now, add 43.5 microliters of magnetic beads to the adapter ligation DNA and mix 20 times. After five minutes, place the tube in a magnetic rack for five to 10 minutes for bead separation and discard the supernatant. Wash the pellet with 100 microliters of 80%ethanol and dry the beads for 30 seconds.To elute the beads in pellet, add 8.5 microliters of 10 millimolar Tris HCl into the tube and incubate for two minutes. Place the tube in a magnetic rack and remove 7.5 microliters of eluded DNA as supernatant into a new tube. Add PCR reagents to the adapter ligated DNA containing tube to set up a 25 microliter reaction.To clean amplified DNA, add 22.5 microliters of magnetic beads into the tube and mix 20 times. After five minutes, remove 50 microliters of supernatant and wash the beads with 100 microliters of 80%ethanol. Resuspend he dark brown beads in 16 microliters of water and mix 20 times.Place the tube in the magnetic rack for 30 to 60 seconds and transfer 15 microliters to a new tube. Mix 90 microliters of buffer, one microliter of dye, and two microliters of DNA library sample and read the DNA concentration on a fluorimeter. After diluting the DNA to two nanomolar, load 27 to 30 microliters of the flow cell and place it in the sequencer.Save the FASTQ files obtained from the sequencer. Click to open a spreadsheet file and create a mapping or metadata file. Open the Nephele website, upload the FASTQ files, and read QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.Next, using DADA2, execute demultiplexed paired-end reads, filter substitution, chimera errors, and merging. Use the Naive Bayes classifier trained on the Silva version 132 99%operational taxonomic unit, or OTU database, to perform bacterial taxonomic assignment at 97%similarity. Open the MicrobiomeDB website.Click to upload the files, and generate OTU alpha diversity, beta diversity, relative abundance, and rarefaction curves. Finally, open a spreadsheet and transfer data to make heat maps, Venn diagrams, and linear discriminant analysis effect size. A heat map based on the relative abundance of bacteria at different stages of winemaking displayed the dominance of phyla such as Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, and Fusobacteriota.At the genus level, important genera like Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae were identified. A Venn diagram analysis revealed 15 shared unique OTUs from the grape must to the final wine. The results of the amplicon sequencing based on the V4 variable region also indicated the alpha diversity in the two traminette R and L.Beta diversity analysis showed a shift in bacteria during fermentation, but the bacterial composition in the final wine was similar to that in the must and yeast added stages.